انجام آزمایشگاهی تست های رایت، کومبس رایت، ME 2 و ویدال
موضوع: ایمنولوژی
انجام آزمایشگاهی تست های رایت، کومبس رایت، ME 2 و ویدال
بروسلوز یا تب مالت بیماری مشترک بین انسان و دام بوده و عفونت در انسان در اثر تماس با حیوانات آلوده یا مصرف فرآورده های دامی بخصوص شیر و مواد لبنی غیر پاستوریزه و تماس با لاشه ی حیوانات آلوده ایجاد می گردد. انتقال بیماری از انسان به انسان نادر است، ولی انتقال از راه شیر مادر به نوزاد، پیوند اعضاء و انتقال خون گزارش شده است.
بیماری توسط کوکوباسیل های گرم منفی، هوازی مطلق و کند رشد ایجاد می شود این باکتری ها فاقد کپسول و اسپور بوده و بی حرکت می باشند بروسلاها برای حیوانات اهلی مانند بز، گوسفند، گاو، خوک بیماری زا بوده و د رحیوانات آلوده موجب سقط جنین و آلودگی غدد شیری حیوان شده و تا سالها از طریق شیرحیوانات منتقل می شوند.
بروسلاها انگل های بیماری زای اختیاری داخل سلولی بوده و پاسخ به بروسلوزیس به واسطه ی سیستم ایمنی سلولی صورت می گیرد و به همین دلیل باکتری می تواند از سیستم ایمنی هومورال فرار کند.
باکتری نسبت به سرما مقاومت نسبی داشته و در آب و خاک و محل تاریک و مرطوب به مدت 2 تا 3 ماه و در ترشحات خشک ناشی از سقط و لاشه ی حیوانات و گوشت در یخچال زنده می ماند.
بیماری در حیوانات موجب مرگ و سقط جنین و کاهش وزن گردیده و زیان های اقتصادی مهمی در زمینه ی تولید گوشت و شیر ایجاد می کند همچنین نازایی در حیوانات آلوده شایع می باشد.
هرچه میزان شیوع بیماری در دام ها بیشتر باشد افراد بیشتری دچار آلودگی و بیماری شده و این خود موجب افزایش هزینه های درمانی و ناتوان نمودن افرادی مانند دامپروران، دامداران ودامپزشکان می گردد.
تاریخچه:
برای اولین بار در سال 1862 نوکاردیا توانست باکتری را در جنین مرده ی گاو نشان دهد در سال 1863 مارستون شرح کاملی از بیماری را در انسان بیان نمود. در سال 1887دیوید بوروس (David Bruce) پزشک انگلیسی باکتری مولد بیماری را از طحال یکی از بیماران که به علت تب مالت در گذشته بود، در جزیره مالت جدا نمود بدلیل اینکه نام قدیمی جزیره ی مالت، ملی تین بود او نام باکتری را میکروکوکوس ملی تن سیس M.melitensis نامید.
در سال 1905 زامیت باکتری را از شیر بزهای جزیره ی مالت بدست آورد و ثابت کرد که بیماری از طریق بزهای آلوده به انسان انتقال می یابد.
در سال 1897 بانک (Bang) توانست باکتری را از ترشحات واژن گاوهایی که سقط جنین نموده بودند، جدا نماید و آن را به نام بروسلا آبورتوس (B.abortus) نامید. در همین سال هاگز (Hughes) این بیماری را به نام تب مواج (Undulant fever) نامید و رایت (Wright) برای تشخیص بیماری از روش سرولوژیکی (آگلوتیناسیون) استفاده نمود.
تروم (Traum) در سال 1914 در ایالات متحده بروسلا سوئیس B.Suis را از خوک ماده ای که سقط جنین نموده بود جدا کرد.
در سال 1920 آلیس اوانس (Alice Evans) ثابت نمود که عامل سقط جنین خوک و گاو از نظر خصوصیات بیولوژیکی و سرولوژیکی با ملی تن سیس قرابت دارد .
بین سالهای 1934-1931 تامسن (thomsen) در دانمارک نمونه های بروسلا سوئیسی جدا نمود که از برخی جهات به نمونه های بدست آمده از خوک ها در امریکا تفاوت داشت. انواع بدست آمده از کشور امریکا در نقاط مختلف اروپا، برزیل، استرالیا و آرژانتین نیز مشاهده می شود.
در سال 1953 بروسلا اویس (B.ovis) از گوسفند و در سال 1975 بروسلا نئوتومه (B.neotomae) از موش های صحرایی و در سال 1968 بروسلا کانیس (B.canis) عامل سقط در سگ شرح داده شد.
طبقه بندی بروسلاها:
بروسلاها براساس میزبان طبیعی، احتیاج به Co2 حساسیت به غلظت مختلف رنگ های تیونین، فعالیت اوره آزی، تولید H2s و لیز توسط فاژها از همدیگر و سایر باکتریها جدا می شوند. این باکتریها گاز منفی و نیترات مثبت بوده و از نظر مقاومت به اسید و حرارت و پاستوریزاسیون حساس می باشند.
باکتری براساس فعالیت متابولیکی و آگلوتیناسیون بوسیله ی آنتی سرمهای اختصاصی به گونه های مختلفی تقسیم بندی می شوند اساس این تقسیم بندی توسط هودلسون (Huddleson) صورت گرفته است.
1- بروسلا ملی تن سیس (B.melitensis): میزبان طبیعی آن بز و گوسفند بوده و شامل 3 بیوتیپمی باشد. این گونه عامل اصلی بروسلوزیس در ایران بوده و اکثر موارد بروسلوزیس را شامل
می شود.
2- بروسلا آبورتوس (B.abortus): میزبان طبیعی آن گاو می باشد و 9 بیوتیپ دارد.
3- بروسلا کنیس (B.Canis): میزبان طبیعی آن سگ می باشد.
4- بروسلا سوئیس (B.Suis): میزبان طبیعی آن خوک، گوزن، اسب و جوندگان می باشد.
5- بروسلا نئوتومه (B.neotomea): معمولا درجوندگان بخصوص رت های جنگلی ایجاد بیماری می کند.
6- بروسلا اویس (B.Ovis): مخزن اصلی آن گوسفندان نیوزیلندی می باشد.
7- بروسلا ماریس (B.maris): از برخی گونه های پستانداران دریایی جدا شده است.
نکته : نمونه هایی غیرقابل آگلوتیناسیون ملی تن سیس، آبورتوس و سوئیس را تحت عنوان
پارا ملی تن سیس، پاراسوئیس و پاراآبورتوس می گویند.
بیماریزایی:
انسان به سه طریق بروسلوز را کسب می کند:
1- از طریق مصرف گوشت نپخته، مواد لبنی غیرپاستوریزه
2- از طریق تماس با بافت ها، خون و سایر مایعات حیوانات آلوده و متعاقب آن ورود ارگانیسم از طریق غشاهای مخاطی، بریدگی و خراش ها
3- استنشاق ارگانیسم بخصوص در هنگام کار در آزمایشگاه
در داخل بدن باکتری ها توسط پلی مورفونوکلئرها (PMN) فاگوسیت شده و زنده می مانند لکوسیت ها بعنوان حامل عمل کرده و آن ها را به بافت های لنفاتیک مختلف مانند کبد، طحال و مغز استخوان منتقل می کنند.
نشانه ی بارز بروسلوزیس حاد تشکیل گرانولوم ها در داخل بافت های لنفاتیک می باشد تکثیر باکتری ها در داخل ماکروفاژها باعث انباشته شدن و تخریب سلولها می گردد و بدنبال آن باکتریمی ایجاد
می گردد اگر پاسخ ایمنی سلولی (CMI) برای کنترل بروسلوز کافی نباشد، کبد، طحال و مغز استخوان و ندول های لنفاوی ممکن است به طور وسیعی در گیرشوند.
در آلودگی به بروسلا سوئیس گرانولوم ها در کلیه ، سیستم اعصاب مرکزی (CNS) بافت های زیر جلدی و بیضه ها و تخمدان تشکیل می شوند.
علفخواران و نشخوارکنندگان در صورت آلوده شدن اغلب به عفونت جفت مبتلا می شوند که باعث سقط سپتیک می گردد. در حالیکه هرگز در عفونت های انسانی این حالت مشاهده نمی شود . دلیل این امر وجود ماده ای بنام اریتریتول است. اریتریتول قندی است که منبع کربن و انرژی برای باکتری ها بوده و عامل تسریع کننده ی رشد وتکثیر باکتری می باشد. در حالیکه در مایع جفت انسان ماده ای بنام اریتروز وجود دارد که برای رشد بروسلا ها مناسب نمی باشد.
یافته های بالینی:
عفونت با بروسلا ملی تن سیس در اکثر مواقع از بزها کسب شده و به سمت عفونت حاد با تظاهرات ناتوان کننده بیمار پیش می رود. عفونت بروسلا آبورتوس از گاو کسب شده و عموما شدت کمتری نسبت به عفونت های بروسلا ملی تن سیس دارد. عفونت بروسلاسوئیس از خوک کسب شده و اغلب با تشکیل نکروز پنیری و آبسه های متعدد در بافت های لنفاوی مشخص می شود.
اشکال بیماری بروسلوزیس:
هرچند دوره ی حاد بیماری با نوع گونه ی بروسلاهای آلوده کننده متفاوت است، ولی در بیشتر از 85% بیماران مبتلا به بروسلوزیس، تظاهرات استئوآرتریکولار مانند آرترالژی، آرتریت، اوستئومیلیت، اسپوندیلیت و سارکومیلیت دیده می شود.
الف – بروسلوز تحت بالینی (Subclinical): علائم آن شامل خستگی و سردرد بوده و این بیماران سابقه ای از تماس با محصولات حیوانی خام یا نشخوارکنندگان دارند.
ب – بروسلوز باکتریمیک : این بیماران یک شکل سیستمیک حاد از بیماری را داشته و در اکثر موارد در اثر آلودگی به بروسلا ملی تن سیس بیماری ایجاد می گردد. بیماران پس از تماس باحیوانات آلوده بعد از حدود 3-2 هفته دچار تب می شوند و تب به شکل بالا و پایین رونده بوده لذا بنام تب مواج یا Undulant fever نامیده می شود.
تظاهرات بیماری شامل سردردهای شدید، استفراغ، ضعف، درد عضلانی شدید و درد در مفصل ها، بزرگی طحال و کبد و غدد لنفاوی می باشد. عفونت های چرکی مفصلی و گاها آسیب کلیه نیز مشاهده می گردد.
ج – بروسلوز سرلوژیک: بیمار علائم سیستمیک خفیفی از بروسلوز داشته و فرد دارای سابقه ای از مصرف شیرخام یا پنیر تازه غیرپاستوریزه می باشد.
د – بروسلوز موضعی: در بیشتر موارد در اثر ابتلا به بروسلا ملی تن سیس و سوئیس ایجاد شده که شروع علائم بالینی تدریجی بوده و شامل درد عضلات، تب و آرتریت می باشد.
ه – بروسلوز مزمن: بروسلوز باکتریمیک یا موضعی ممکن است با عود و تشدید بیماری به شکل مزمن در آید که در طی ماهها و سالهای متمادی رخ می دهد. تظاهرات نوع مزمن بصورت آبسه های کبدی، آبسههای طحالی، مننژیت، هپاتیت گرانولوماتوز، آندوکاردیت و اولسرهای پوستی مزمن دیده شود.
نکته: بروسلوزیک بیماری مشترک بین انسان و حیوان (زئونوز) می باشد. بروسلا ملی تن سیس نوع حاد و شدید بیماری را ایجاد کرده در حالیکه بروسلا آبورتوس و کنیس بیماری خفیف تری ایجاد
می کنند که بندرت موجب عوارض شدید می شود نکروز پنیری و چرک از عوارض بروسلا سوئیس می باشد.
مورفولوژی:
باکتری به شکل کوکوباسیل های کوتاه بطول 6/0 تا 5/1 میکرومتر و عرض حدود 5/0 تا 7/0 میکرومتر می باشد. در محیط های غنی حاوی خون و سرم اشکال بلندتر باسیل مشاهده می شود. در محیط مایع بصورت زنجیره های کوتاه دیده می شود. ملی تن سیس بیشتر بصورت کوکوباسیل و آبورتوس به شکل باسیل های کوتاهتر دیده می شود. پس از رنگ آمیزی با روش گرم باکتری بصورت گرم منفی دیده می شود ولی اسیدفاست نمی باشد.
در صورت استفاده از روش کوستر Koster باکتری در داخل سلولها به رنگ قرمز قابل مشاهده است.
متابولیسم بروسلا:
بروسلاها دارای متابولیسم تنفسی بوده و انرژی خود را از راه اکسیداتیو بدست می آورند. هوازی مطلق بوده و در غیاب کامل هوا رشد نمی کنند. بروسلا آبورتوس و بروسلا اویس برای کشت اولیه ی خود احتیاج به وجود 10-5% گاز co2 داشته ولی پس از چند بار کشت این نیاز برطرف
می شود.
باکتری قدرت تخمیری نداشته و قادر است برخی از قندها و اسید آمینه ها را اکسیده نماید.
راه های انتقال بیماری:
1- دستگاه گوارش: مصرف شیر و لبنیات آلوده و غیرپاستوریزه و گوشت نپخته
2- دستگاه تنفس: استنشاق ذرات آلوده مانند ترشحات واژن و جنین های سقط شده
3- مخاط: خراش های جزئی موجود در پوست، مخاط ملتحمه ی چشم
بیماری در میان کسانیکه از نظر شغلی با تهیه ی گوشت سروکار دارند مانند قصاب ها، دامپروران و دامپزشکان نسبت به سایر افراد بیشتر است.
دوره نهفتگی:
بیماری در عرض 30-5 روز پس از آلوده شدن فرد ظاهر می شود. ولی گاهی به چند ماه نیز می رسد در موارد آلودگی به بروسلا آبورتوس بدلیل قدرت تهاجمی کمتر در انسان عفونت با علائم ناآشکار و کمتر به شکل حاد رخ می دهد. شروع بیماری بسته به واکنش سیستم ایمنی می تواند ناگهانی و یا تدریجی و بدون علائم شدید باشد.
علائم بیماری:
سردرد، دردعمومی بدن بخصوص درد در پشت و ستون مهره ها، لرز، عرق های شبانه، تب مواج یا متناوب که عصرها بالا رفته و همراه عرق می باشد گاها در اوج تب دمای بدن به 41 درجه ی سانتیگراد نیز می رسد.
بیخوابی، درد مفصل ها و تورم مفاصل، بی اشتهایی و ضعف شدید، بزرگی طحال، حساس شدن و بزرگی غدد لنفاوی و کبد، هپاتیت و مشکلات حرکتی در بیمار بخصوص در ناحیه کمر و پاها مشاهده می شود.
علائم آزمایشگاهی شامل لکوپنی به همراه کاهش پلی مورفونوکلئرها می باشد.
اغلب اوقات علائم بیماری پس از درمان با آنتی بیوتیک، تمایل به بازگشت داشته و برای هفته ها حتی ماهها نیز ادامه می یابد بیماری تمایل به مزمن شدن داشته و حتی تا سالها باقی می ماند.
شدت بیماری زایی بروسلاها بستگی به قدرت تهاجم، اندوتکوسین، زندگی و بقا در داخل سلولها و مکانیسم های ایمنولوژیکی دارد. باکتری توسط مجاری لنفاوی از محل ورود، خود را به غدد لنفاوی رسانده و بسته به قدرت تهاجمی باکتری و واکنش سیستم ایمنی بدن بوسیله پلی مورفونوکلئرها و ماکروفاژها از بین رفته یا در غیراینصورت تکثیر یافته و وارد خون می گردد توسط گردش خون به کبد، طحال، مغزاستخوان، غدد لنفاوی، ریه و کلیه منتقل شده در داخل سلولها می تواند زنده بماند.
ساختمان آنتی ژنتیک:
بر روی سطح بروسلا دو نوع آنتی ژن وجود دارد آنتی ژن M که قسمت اعظم سطح باکتری در نوع بروسلا ملی تن سیس را می پوشاند، در صورتیکه در بروسلا آبورتوس، آنتی زن نوع A در سطح باکتری به مقدار زیاد وجود دارد در نوع بروسلا سوئیس مقدار آنتی ژن نوع A بیشتر بوده و به مقدار کمی آنتی زن نوع M نیز دارد.
این شاخص های آنتی ژنتیکی در واقع قسمتی از کمپلکس لیپوپلی ساکارید و پروتئین دیواره سلولی باکتری است.
اخیرا نوع دیگری از آنتی ژن سطحی دیگر بنام آنتی ژن L که مشابه آنتی زن Vi سالمونلاهاست
در بروسلاها نیز یافت شده است. ضمنا در سطح باکتری یک آنتی ژن مشترک دیگر بنام
(Native Hapten)NH یافت شده و دارای ترکیبات پلی ساکاریدی مانند گلوکز، مانوز و کینوزامین می باشد.
AgM AgA
بروسلا ملی تن سیس +++ +
بروسلا آبورتوس + +++
بروسلا سوئیس + ++
جدول 1- نسبت آنتی ژنهای موجود در سطح بروسلا ها
سم :
بروسلاها اگزوتوکسین تولید نمی کنند ولی مشابه سایر باکتریهای گرم منفی دارای آندوتوکسین (لیپوپلی ساکارید) می باشند. حساسیت فرد نسبت به اندوتوکسین بروسلاها یکی از عوامل مهم در بیماریزایی باکتری است.
بیماریزایی در حیوانات:
گونه های بروسلا برای میزبانان اصلی خود نسبت به سایر میزبان ها، مسری تر می باشند. مثلا بروسلا آبورتوس برای گاوها مسری تر است تا نسبت به بزها و انتشار بیماری توسط سایر گونه ها کمتر مشاهده می شود.
خوکچه هندی نسبت به بروسلاها حساسیت بیشتری دارد و تزریق مقدار زیادی باکتری در داخل صفاق موجب مرگ حیوان می شود خرگوش حساسیت کمتری نسبت به خوکچه هندی داشته و
آنتی بادی خوبی بر علیه این باکتری تولید می کند. پرندگان بطور کلی مقاوم بوده ولی جنین آن ها حساس هستند. بروسلا ملی تن سیس برای بز، گوسفند، خوک، شتر و بعضی حیوانات نیمه اهلی دیگر بیماریزا می باشد.
بروسلا آبورتوس برای گاو، بوفالو، خوک، اسب، گوسفند، مرغ، خوکچه هندی بیماریزا می باشد.
بروسلا سوئیس برای گاو، خوک، گوزن شمال، گوز کانادایی، اسب، سگ، مرغ و خروس وحشی بیماریزا می باشد ولی برای بز بیماریزا نیست.
بروسلا کانیس بعنوان عامل بیماریزایی مهمی در سگ ها شناخته شده است.
حیوانات فوق برحسب درجه حساسیت شان به باکتری، علائمی از قبیل تب، بزرگی غدد لنفاوی و سقط جنین نشان داده و حتی در برخی موارد هیچگونه علائمی را بروز نمی دهند.
پراکندگی جغرافیایی:
بیماری بروسلوز در تعدادی از کشورهای پیشرفته تقریبا ریشه کن شده، اما این بیماری از تمام نقاط دنیا گزارش می شود. بروسلوز انسانی به مقدار فراوان در کشورهایی مانند افریقا، خاورمیانه، هند و کشورهای در حال توسعه به تعداد زیادی گزارش می گردد. هر ساله بیشتر از 500 هزار نفر به بروسلوزیس مبتلا شده در حالیکه تعداد کمی از این افراد شناسایی و درمان می شوند.
گونه ی غالب در کشور و استان ما گونه ملی تن سیس بوده، البته این گونه شایعترین گونه ی بروسلا در دنیا نیز می باشد. میزان آلودگی در مردان نسبت به زنان تقریبا 6 برابر بیشتر بوده و این به دلیل رابطه ی شغلی این گروه جنسی (مانند قصابان، چوپانان، سلاخ ها، دامپزشکان، دباغ ها و دامپروران) می باشد.
سن ابتلا به این بیماری در افراد 25-15 سال بیشتر از سایر افراد می باشد.
بیماری در فصل بهار و تابستان که فصل باروری و زایمان دامهاست ، شیوع بیشتری داشته و علت آن تماس با بافت های آلوده دامی مانند جفت، ترشحات دستگاه تنفس دامها و مصرف شیر و لبنیات تازه می باشد.
تشخیص:
فرد بیمار با علائمی مانند تب، درد عضلانی و استخوانی، بی حالی، ضعف و کاهش اشتها به پزشک مراجعه می کند. با انجام آزمایشات سرولوژیکی و میکروبیولوژیکی تشخیص قطعی داده
می شود.
تشخیص آزمایشگاهی:
1- آزمایشات بیوشیمیایی:
اکثر آزمایشات بیوشیمیایی در محدوده ی نرمال بوده هرچند ممکن است سطح آنزیم های کبدی مقداری افزایش نشان دهد. میزان گلبولهای سفید خون معمولا پایین تر بوده و گاها آنمی وجود دارد میزان CRP, ESR ممکن است افزایش نشان دهد.
2- آزمایشات میکروبیولوژی:
کشت خون:
تشخیص قطعی بروسلوزیس با یافتن باکتری در نمونه ی خون، نمونه ی مغزاستخوان، مایعات بدن و نمونه های بافتی حاصل می گردد. کشت مغز استخوان نسبت به کشت نمونه خون بخصوص قبل از شروع مصرف آنتی بیوتیک از اهمیت ویژه ای برخوردار است. در بیماران مبتلا به نوع ملی تن سیس کشت خون در بیشتر از 70% موارد و کشت مغز استخوان در بیشتر از 90% موارد مثبت
می گردد. کشت روش طلایی برای بدست آوردن ارگانیسم و تایید بیماری می باشد.
کشت نمونه ی خون باید در 2-1 هفته ی اول بیماری و قبل از شروع مصرف آنتی بیوتیک صورت گیرد.
بروسلا ملی تن سیس نسبتا راحت تر از بروسلا آبورتوس از کشت خون بدست می آید.
از بهترین محیط های کشت خون می توان به محیط دی فازیک کاستاندا اشاره نمود. از محیط های کشت معمولی مانند سرم دکستروز مایع و محیط کشت مایع بروسلا براث نیز می توان استفاده نمود. اخیرا از روش BACTEC جهت کشت استفاده شده که می توان در مدت حدود 10 روز باکتری را در صورت مثبت بودن نمونه بدست آورد.
در انجام کشت خون در محیط دی فازیک کاستاندا باید در شرایط کاملا استریل از بیمار خونگیری نموده و مقدار 10-8 میلی لیتر خون به ظرف محیط کشت کاستاندایا بروسلا براث اضافه نمود.
در صورت استفاده از محیط کاستاندا نیازی به پاساژهای مکرر نبوده ولی در صورت استفاده از محیط سرم دکستروزیا بروسلا براث باید از روز چهارم به بعد هفته ای دوبار کشت در محیط بروسلا آگار یا سرم دکستروز آگار برای بدست آوردن باکتری صورت گیرد. کلنی باکتری بعد از 3-2 روز به صورت محدب، صاف، شفاف و فاقد پیگمان به اندازه ی حدود 1-5/0 میلی متر ظاهر می گردد. پس از بدست آوردن کلنی باکتری آزمایشات بیوشیمیایی مانند تولید H2S ، اوره آز، نیترات، کاتالاز، اکسیداز، رشد درحضور فوشین بازی و تیونین، عدم تحرک بر روی کلنیها صورت می گیرد.
مخزن طبیعی نیاز به Co2 تولید H2S رنگ فرشین بازی رنگ تیونین
ملی تن سیس بز – گوسفند – – + +
آبورتوس گاو + + + –
سوئیس خوک – – + +
کانیس سگ – – – +
جدول 2- واکنش های بیوشیمیایی در انواع بروسلاها
3- آزمایشات سرولوژیکی:
به دلیل طولانی بودن پروسه ی آزمایشات کشت خون یا سایر مایعات بدن، روش های سرولوژیکی بدلیل کوتاه بودن زمان انجام آن بیشتر مورد استفاده قرار می گیرد. اساس آزمایشات سرولوژیکی جستجوی مقدار آنتی بادی اختصاصی تولید شده در بدن بیمار می باشد.
آنتی بادیهای (ایمنولوگلوبین) تولید شده در بیماری بروسلوز شامل IgG, IgM و به مقدار جزئی IgE بوده، در اوایل بیماری تیتر IgM به مقدار زیادی افزایش یافته و برای تشخیص اولیه بیماری دارای ارزش بالایی است معمولا میزان IgM از هفته ی دوم آلودگی افزایش یافته و از هفته ی سوم به بعد بتدریج میزان IgG در سرم شروع به افزایش می کند.
برای تشخیص سرولوژیکی بیماری بروسلوزیس از آزمایشات آگلوتیناسیون سریع (Rapid) با روش رزبنگال، آگلوتیناسیون رایت لوله ای، 2ME ، آزمایش کومبس رایت استفاده می گردد.
نکته: برای آزمایشات سرولوژیکی از نمونه ی سرم بیمار که عاری از هرگونه همولیز، یرقان و لیپمیک است باید استفاده کرد.
آزمایشات سرولوژی استاندارد:
1- آزمایش آگلوتیناسیون سریع (Rapid Slide Agglutination Test)
آنتی ژن رزبنگال به رنگ قرمز و با PH اسیدی برابر 65/3 و به میزان 8% جرم میکروبی سویه 99 بروسلا آبورتوس جهت این آزمایش استفاده می شود.
این روش از بهترین آزمایشات مقدماتی سرولوژیکی تب مالت می باشد و نخستین بار توسط دکتر نیکولتی کارشناس سازمان بهداشت جهانی در ایران معرفی گردید. روشی است ساده و مطمئن و خیلی زود جواب می دهد و بیشتر برای تشخیص اولیه در برنامه های کنترل و ریشه کنی بروسلوز بعنوان تست غربالی بکار برده می شود. اما بعلت احتمال بروز پدیده پروزون و مشاهده پاسخ منفی کاذب، آزمایش تمام نمونه ها باید با روش لوله ای نیز انجام شود.
روش آزمایش :
برای انجام آزمایش به روش سریع بر روی پلیت یک قطره سرم حدود 30-25 میکرولیتر و یک قطره آنتی ژن به همان مقدار مساوی ریخته و با اپلیکاتور کاملا به هم می زنیم. پلیت را به مدت 5 دقیقه جهت انجام واکنش آنتی ژن و آنتی بادی روی روتاتور قرار داده و سپس از نظر آگلوتیناسیون بررسی می شود موارد مثبت باید با روش لوله ای تیتر شود و از تیتراسیون آزمایش با پلیت خودداری گردد بهتر است در آزمایش از نمونه های کنترل مثبت و منفی جهت مقایسه آگلوتیناسیون استفاده گردد.
2- آزمایش آگلوتیناسیون لوله ای یا ازمایش رایت لوله ای (Standard tube Agglutination Test)
روش آزمایش :
در یک ردیف لوله ی همولیز از سرم بیمار رقت های 10/1 تا 640/1 و رقت های بالاتر در حد نیاز تهیه می شود.
الف – در لوله ی اول 9/0 میلی لیتر و در لوله های بعدی 5/0 میلی لیتر سرم فیزیولوژی فنیکه ریخته می شود.
ب – 1/0 میلی لیتر از سرم مورد آزمایش به لوله ی اول اضافه کرده و سپس از لوله ی اول 5/0 میلی لیتر به لوله ی دوم و از لوله دوم به لوله ی سوم و به این ترتیب تا آخرین لوله ادامه داده و از آخرین لوله 5/0 میلی لیتر دور ریخته می شود.
ج – آنتی ژن رایت لوله ای به مقدار 5/0 میلی لیتر به تمام لوله ها اضافه می شود.
رقت نهایی لوله ها از 20/1 شروع شده و به ترتیب 40/1 و 80/1 و 160/1 و …. ادامه می یابد.
لوله ها را کاملا به هم زده و درب لوله ها را با پارافیلم بسته و مدت 24 ساعت در اتو 37 درجه سانتیگراد نگهداری می شود و سپس نتایج قرائت می شود.
قرائت نتایج:
بر مبنای میزان شفافیت مایع فوقانی لوله ها (با مقایسه لوله شاهد) و آگلوتیناسیون
ایجاد شده، نتایج گزارش می شود. وجود شفافیت دلیل بر آگلوتیناسیون مثبت و عدم شفافیت نشان دهنده ی عدم آگلوتیناسیون می باشد. بیشترین رقت لوله ای که نسبت به لوله ی شاهد منفی، 50 درصد شفافیت یا آگلوتیناسیون را نشان دهد، تیتر نهایی آزمایش می باشد.
در مورد تفسیر آزمایش رایت و تعیین تیتر آلودگی اتفاق نظر وجود ندارد. در کشورهای غربی به علت اینکه بیماری شیوع چندانی ندارد وتعداد بیماران اندک است و فقط یک بیماری شغلی محسوب می شود، آلودگی با بروسلا آبورتوس و سوئیس با تماس مکرر بوجود می آید و آلودگی با بروسلا ملی تن سیس رواج ندارد، لذا تیتر قابل ارزش برای درمان 160/1 می باشد. ولی در ایران که بیشترین آلودگی با بروسلا ملی تن سیس گزارش گردیده تیتر 80/1 به بالا برای درمان ارزش بیشتری دارد. اما تیترهای پایین تر بویژه در ارتباط با بیماریهای غیرشغلی نبایستی کم اهمیت در نظر گرفته شود مگر در مواردیکه علائم کلینیکی وجود نداشته باشد.
در این موارد آزمایش دو هفته بعد تکرار می شود در صورت عدم افزایش تیتر و منفی بودن 2ME پاسخ منفی تلقی می گردد.
تهیه ی شاهد مثبت و منفی برای آزمایش رایت لوله ای:
1- تهیه شاهد منفی: 5/0 میلی لیتر آنتی ژن رقیق یا آماده ی مصرف را در یک لوله ی همولیز ریخته و 5/0 میلی لیتر محلول سرم فیزیولوژی فنیکه به آن می افزاییم.
2- تهیه ی شاهد مثبت: یک نمونه سرم مثبت قوی را به صورت 5/1 رقیق کرده
(100 میکرولیتر سرم + 400 میکرولیتر سرم فیزیولوژی) سپس 5/0 میلی لیتر از آن را با 5/0 میلی لیتر آنتی ژن در لوله مخلوط می نماییم.
طرز تهیه سرم فیزیولوژی فنیکه: 5/8 گرم کلرید سدیم و 5 گرم فنل را در 1000 میلی لیتر آب مقطر حل نمایید. توصیه می شود برای از بین بردن پدیده ی پروزون از سرم فیزیولوژی غلیظ استفاده شود که در آن بجای 5/8 گرم نمک طعام، 50 گرم فنل در یک لیتر آب حل شود.
موارد مثبت کاذب آزمایش رایت:
1- ابتلا به وبا
2- ابتلا به تولارمی
3- عفونت ناشی از یرسینیا آنتروکولیتیکا
تماس با واکسن های حاوی ویبریوکولرا، فرانسیسلا و یرسینیا
4- عفونت های ناشی از گونه های سالمونلا، پسودومونا مالتوفیلا و اشرشیای 0116
5- انجام تست بروسلین
موارد منفی کاذب آزمایش رایت:
1- سرم بیماران مبتلا به بروسلوز ناشی از گونه کانیس که معمولا آنتی ژن استاندارد بروسلا کانیس را آگلوتینه نمی کند و جهت تشخیص این نوع بروسلا، باید از تست های اختصاصی استفاده نمود.
2- زمانیکه سرم بیمار تا بیش از 320/1 رقیق نشود، بعلت احتمال بروز واکنش پروزون، ممکن است نتیجه بصورت منفی کاذب گزارش گردد.
3- در موارد مزمن بیماری به علت پایین بودن میزان IgM یا عدم وجود آن و دخالت ایمنوگلوبولین های ناقص در واکنش و اشغال گیرنده های آنتی ژنی بوسیله ی آن ها ممکن است واکنش آگلوتیناسیون صورت نگیرد، هر چند در چنین مواردی با توسل به آزمایش کومبس رایت و استفاده از آنتی هیومن گلوبولین می توان از بروز چنین واکنشی جلوگیری کرد.
4- در موارد نقص سیستم ایمنی و کمبود گاماگلوبولین ها
5- در صورتیکه قبل از تشکیل آنتی بادی کافی (مثلا اوایل بیماری حاد) تست رایت، انجام شود بدلیل عدم تولید آنتی بادیهای اختصاصی نتیجه ی منفی خواهیم داشت.
واکنش پروزون (Prozone) :
یکی از موارد منفی کاذب تست هایی که براساس فعل و انفعالات آنتی ژن – آنتی بادی انجام می شود پدیده منطقه ای یا پروزون است.
در اینگونه آزمایشات بایستی مقادیر متناسبی از آنتی ژن و آنتی بادی، وجود داشته باشد تا واکنش کاملی صورت گیرد و در صورت وجود مقادیر زیادی آنتی ژن و آنتی بادی، نتایج حاصله می تواند بصورت واکنش ضعیف یا منفی جلوه گر شده و پاسخ کاذب به بارآورد در انجام این آزمایشات هرگاه نمونه ی مورد آزمایش به اندازه ی کافی رقیق نشود مقادیر زیادی آنتی بادی وجود خواهد داشت و واکنش قابل رویت ایجاد نخواهد شد این حالت را پدیده ی پروزون می نامند.
در صورت زیاد بودن مقدار آنتی ژن مصرفی (در اثر اشتباه آزمایشگاهی) نیز این حالت ایجاد می گردد که با رقیق کردن آنتی ژن برطرف می شود و به آن واکنش پست زون (Post zone) می گویند.
قابل تاکید است که برای از بین بردن واکنش پروزون لازم است سرم بیماران تا عیار 1280/1 رقیق شود.
آزمایش 2- مرکاپتواتانول 2-Mercaptoethanel (2ME) :
تستهای معمول آگلوتیناسیون برای تشخیص بروسلوز تنها وجود یا عدم وجود آگلوتینین های ضد آنتی ژن بروسلا را در سرم بیمار مشخص می کند اما نوع آگلوتینین های موجود یعنی IgM, IgG را افتراق نمی دهد.
آزمایش 2ME برای تعیین ماهیت ایمنوگلوبولین موجود در سرم می باشد مرکاپتواتانول ماده ی احیا کننده ای است که سبب شکسته شدن باندهای دی سولفید IgM شده و باعث از بین رفتن آن و نهایتا از بین رفتن آگلوتیناسیون می شود هرگاه سرم بیمار پس از مجاورت با 2ME آگلوتیناسیون نشان ندهد، دلیل بر وجود آگلوتینین IgM بوده ولی اگر قدرت آگلوتیناسیون سرم باقی بماند دلیل بر وجود آگلوتینین IgG بوده و تیتر بدست آمده همان تیتر IgG می باشد.
روش اول آزمایش:
آزمایش 2ME به همان روش آگلوتیناسیون رایت لوله ای انجام می شود با این تفاوت که رقت های سرم بجای سرم فیزیولوژی با بافر 2ME تهیه می گردد.
1- به تعداد نمونه های مورد آزمایش لوله ی همولیز در نظر گرفته و در لوله اول 9/0 میلی لیتر بافر 2ME و 10/0 میلی لیتر سرم بیمار و در لوله های بعدی 5/0 میلی لیتر از محلول مرکاپتواتانول (بافر 2ME) اضافه می کنیم.
2- لوله ها را کاملا به هم زده و از لوله ی اول 5/0 میلی لیتر به لوله ی دوم و از لوله ی دوم به لوله ی سوم و الی آخر اضافه کرده و از لوله ی آخر 5/0 میلی لیتر به بیرون ریخته و بعد به تمام لوله های 5/0 میلی لیتر آنتی ژن 2ME اضافه می کنیم.
3- لوله ها را به مدت 24 ساعت در اتو 37 درجه قرار داده و سپس از نظر وجود آگلوتیناسیون بررسی می کنیم.
روش دوم آزمایش 2ME :
1- به تعداد نمونه های مورد آزمایش لوله ی همولیز در نظر گرفته و در هر لوله 3/0 میلی لیتر سرم فیزیولوژی و 2/0 میلی لیتر سرم بیمار و 5/0 میلی لیتر محلول 2ME اضافه می کنیم.
2- لوله ها را به مدت یک ساعت در اتو 37 درجه قرار می دهیم تا محلول 2ME روی IgM اثر کند.
3- لوله ها را از اتو خارج کرده و برای هر نمونه مانند روش رایت لوله ای به تعداد مورد نیاز لوله ی همولیز در نظر می گیریم و رقت های سریال تهیه می کنیم. به این ترتیب که به استثناء لوله ی اول در بقیه ی لوله ها 5/0 میلی لیتر سرم فیزیولوژی می ریزیم سپس از محتوی لوله ی اول 5/0 میلی لیتر به لوله ی دوم و از لوله ی دوم به لوله ی سوم تا لوله ی آخر ادامه می دهیم. از لوله ی آخر 5/0 میلی لیتر دورریخته می شود.
4- به هر لوله 5/0 میلی لیتر آنتی ژن 2ME می ریزیم.
5- لوله ها را به مدت 24 ساعت در اتو 37 درجه قرار داده و سپس وجود آگلوتیناسیون را بررسی می کنیم.
رقت نهایی لوله ها از 20/1 شروع می شود.
تفسیر آزمایش 2ME :
در صورتیکه سرم بیمار حاوی آنتی بادی IgM باشد در اثر تاثیر بافر 2ME از بین می رود و نتیجه ی آگلوتیناسیون منفی می باشد. در مراحل حاد بیماری این حالت مشاهده می شود.
هرگاه بیمار در مراحل مزمن بوده و آنتی بادی IgG در سرم موجود باشد بعد از آزمایش 2ME ، وجود IgG باعث مشاهده ی آگلوتیناسیون خواهد شد.
تیتر 40/1 به بالا در آزمایش 2ME مثبت تلقی می شود. ضمن اینکه تیتر 20/1 می تواند نشانه ای از آلودگی باشد.
آزمایش آنتی هیومن گلوبولین (کومبس رایت) :
در بروسلوز مزمن و طول کشیده ممکن است آنتی بادی تولید نشود و به جای زیر کلاس های G2, G1 که بیش از 80% IgG موجود را تشکیل می دهند، بیشتر IgA, G4, G3 تشکیل
می شوند که از نظر کمی و کیفی ضعیف تر از IgM, G2, G1 هستند.
این آنتی بادیها در تست رایت نتیجه ی منفی کاذب بوجود می آورند ولی در صورت افزودن
آنتی هیومن گلوبولین و انجام تست کومبس رایت نتیجه مثبت خواهد شد.
در تست کومبس رایت تیتر بالاتر از 40/1 ارزش تشخیص داشته و وجود علائم بالینی نتیجه را با ارزش می کند.
روش آزمایش :
1- مطابق آزمایش رایت لوله ای رقت های مورد نیاز را تهیه کرده و همان مراحل را انجام داده و لوله ها را به مدت 24 ساعت در اتو 37 درجه قرار می دهیم.
2- وجود آگلوتیناسیون را در لوله ها بررسی کرده و لوله هایی که دارای آگلوتیناسیون کامل یا جزئی باشند کنار می گذاریم.
3- بقیه ی لوله ها را به مدت 15 دقیقه با دور 2000 سانتریفوژ می کنیم. مایع روئی را دور ریخته و رسوب را سه مرتبه با یک میلی لیتر سرم فیزیولوژی مخلوط و مجددا سانتریفیوژ می کنیم (مرحله ی شستشو)
4- رسوب نهایی را با 9/0 میلی لیتر سرم فیزیولوژی و 1/0 میلی لیتر آنتی هیومن گلوبولین مخلوط کرده و به مدت 24 ساعت در اتو 37 درجه قرار می دهیم.
5- لوله ها را از نظر وجود آگلوتیناسیون بررسی می کنیم.
آزمایش ثبوت مکمل Complement Fixation test :
آزمایش ثبوت مکمل یکی از تست های با ارزشی است که اگر با آزمایش رایت لوله ای همراه شود نتیجه ی کاملا روشنی بدست می آید.
آزمایش ثبوت مکمل اولین بار در سال 1894 توسط پفیفر (Pfeiffer) کشف شد. به این دلیل آن را پدیده ی پفیفر یا باکتریولیز نامیدند.
بعدها مچنیکف (Mechnikoff) نشان داد که این پدیده در لوله آزمایش قابل انجام است.
مدتی بعد واسرمن و همکارانش این آزمایش را در تشخیص سیفلیس بکار بردند و از آن به بعد بنام تست واسرمن معروف شد.
آزمایش ثبوت مکمل از دو مرحله تشکیل می شود:
در مرحله اول، در لوله ی آزمایش مقدار مشخصی آنتی ژن ریخته، سپس سرم بیمار را به آن اضافه می کنیم. بعد به مجموعه ی فوق مقدار معینی کمپلمان اضافه می کنیم. هرگاه سرم حاوی آنتی بادی اختصاصی باشد با آنتی ژن واکنش داده و کمپلکس ایمنی تشکیل می شود و کمپلمان جذب این کمپلکس می گردد.
در مرحله ی دوم گلبول قرمز حساس شده (گلبول قرمز پوشیده از آنتی بادی) و همولیزین به لوله ی آزمایش اضافه می شود. اگر در محیط کمپلمان وجود نداشته باشد، همولیز مشاهده نخواهد شد اما در صورت عدم وجود آنتی بادی و نهایتاٌ آزاد ماندن کمپلمان، همولیز مشاهده خواهد شد. بنابراین در آزمایش CFT مشاهده ی همولیز دلیل برعدم وجود آنتی بادی و منفی بودن آزمایش و عدم مشاهده ی همولیز دلیل بر وجود آنتی بادی در سرم و مثبت بودن تست است.
این آزمایش بسیار حساس بوده و بوسیله ی آن می توان غلظت های بسیار کم آنتی بادی را نیز
اندازه گیری کرد.
از این آزمایش می توان در تشخیص بیماریهای عفونی نظیر فلج اطفال، آبله، انفلوانزا، تب مالت، اوریون، سرخک؛ سیفلیس و سوزاک نیز استفاده کرد.
در بیماری تب مالت، آزمایش ثبوت مکمل در مرحله ی بیماری مثبت است اما کمکی به تشخیص نمی کند زیرا در این زمان آنتی ژن رایت لوله ای نیز مثبت است . معمولا شش ماه پس از بهبودی این آزمایش منفی می شود.
در موارد مزمن بیماری یک آزمون کومبس رایت مثبت و ثبوت مکمل به مقدار 16/1 یا بیشتر شواهدی بر ادامه ی بیماری می باشد. در دامپزشکان و کسانیکه با دام ها سروکار دارند کومبس و ثبوت مکمل مثبت الزاما نشانگر بیماری فعال نخواهد بود.
آزمایشات اختصاصی برای تشخیص بروسلا ها:
1- فعالیت اوره آز :
یک لوپ از سوسپانسیون کدر میکروبی یا از محیط کشت مایع حاوی باکتری را در محیط افتراقی اوره کشت داده ، سپس محیط را سریعا در اتو 37 درجه حاوی 10% گاز کربنیک گذاشته و تغییر رنگ سطح محیط را بررسی می کنیم. فعالیت اوره آزی با تغییر رنگ محیط از زرد به صورتی یا صورتی مایل به ارغوانی تایید می گردد.
2- تولید هیدروژن سولفوره (H2S):
برای انجام آزمایش از نوارهای کاغذی مخصوص آزمایش که با محلول 10% استات سرب آغشته
می گردند استفاده می شود. این لوله ها سفید رنگ می باشند وچنانچه در معرض گازSH2 قرار بگیرند رنگشان تیره می شود و میزان تغییر رنگ از + تا +++ گزارش می شود.
3- رشد در حضور مواد رنگی:
این آزمایش برای بررسی رشد باکتری در خصوص مواد رنگی مثل فوشین بازی و تیونین انجام
می گیرد. 1/0 گرم از هرکدام از رنگ هایی که می خواهیم رشد باکتری را در حضور آن بررسی کنیم در 100 میلی لیتر آب مقطر حل کرده و می جوشانیم سپس 2 میلی لیتر از آن را به 100 میلی لیتر محیط کشت مثل بروسلا آگار قبل از تقسیم محیط به پلیت ها اضافه می کنیم. باکتری مورد نظر را در این محیط کشت می دهیم. رشد باکتری دلیل بر مقاومت باکتری به ماده ی رنگی است.
روش ELISA:
الیزا یک روش سریع و قابل اعتماد است که حساسیت آن نسبت به روش های رایت لوله ای و فیکساسیون کمپلمان بیشتر است در این روش آنتی بادیهای ضد بروسلایی قابل سنجش است علاوه بر آن می توان کلاس آنتی بادی IgM, IgG را هم مورد تشخیص قرار داد. در نتیجه برای افتراق مرحله ی حاد از مزمن تب مالت می توان از این روش استفاده کرد.
ایمنی:
بیشتر عفونت های بروسلایی در انسان توسط مکانیسم های ایمنی مهار شده و میزان عفونت های بدون علامت 10 برابر بیشتر از عفونت های دارای علائم بالینی است.
تعدادی از دامپزشکان و قصابان بدون وجود علائم بالینی عیارهای بالایی از آنتی بادی دارند. تقریبا 95-90 درصد از بیماران پس از یک بار ابتلا نسبت به عفونت بعدی مصونیت پیدا می کنند البته این مصونیت موقتی می باشد.
در بروسلوز هم ایمنی هورمون و هم ایمنی سلولی دخالت دارند بروسلاها انگل داخل سلولی هستند و عامل مهم مصونیت در بروسلوز، مقاومت سلولهای بیگانه خوار می باشد زیرا ماکروفاژها در حیوان ایمن باعث از بین رفتن ارگانیسم های داخل سلولی شده و از انتشار عفونت در میزبان جلوگیری
می کند.
نقش آنتی بادیها در ایجاد مصونیت فقط در خصوص باکتری های خارج سلولی موثر است و این
آنتی بادیها برای بروسلاهای داخل سلولی اثری ندارند.
بدنبال تهاجم باکتری یک حساسیت تاخیری اختصاصی نسبت به آنتی ژن بروسلا حاصل می شود که این واکنش بطور مشخص به میزان تکثیر ارگانیسم های زنده بستگی دارد و برای ایجاد مصونیت ضروری است. زیرا اجزاء ارگانیسم کند شده بندرت باعث بروز این حساسیت می شود. پس از شروع عفونت به فاصله کوتاهی آنتی بادیهای اختصاصی از نوع IgM و پس از آن از نوع IgG تشکیل
می گردد. حضور آنتی بادی اختصاصی که بعنوان اپسونین عمل می کند باعث تسریع فاگوسیتوز میکروبها توسط گلبولهای سفید چند هسته ا ی و فاگوسیت ها می گردد.
در عفونت های مزمن یک عامل مهار کننده ی اختصاصی ظاهر می شود، که از فعالیت ضد میکروبی سیستم کمپلمان جلوگیری می کند.
اپیدمیولوژی :
با آنکه بروسلوز در برخی از کشورهای پیشرفته جهان تقریبا ریشه کن شده است اما این بیماری همچنان از تمام نقاط دنیا گزارش می شود (جدول 4). حتی میزان بروز بیماری حیوانی و انسانی در بسیاری از نقاط دنیا افزایش یافته است. در حال حاضر بروسلوز انسانی به تعداد قابل ملاحظه از روسیه، آفریقا، خاورمیانه، هند، اروپا و آمریکا گزارش می گردد و طبق گزارش سازمان بهداشت جهانی (WHO) سالیانه حدود 500.000 مورد بروسلوز ثبت شده، به این سازمان گزارش می شود البته موارد بروسلوزی که در سطح جهان، بروز می نماید خیلی بیشتر از نیم میلیون موردی است که همه ساله به سازمان بهداشت جهانی گزارش می گردد. بطوری که تخمین زده می شود تنها 4 درصد موارد بروسلوز، تشخیص داده شده و تحت درمان قرار می گیرند.
طبق گزارش مرکز بهداشت استان آذربایجان شرقی میزان بروز بروسلوز در استان در سال 1384 نسبت به سال 1383 تقریبا دو برابر شده است. گونه ملیتنسیس، شایعترین گونه بروسلا در سراسر دنیا می باشد.
در کشورهای پیشرفته صنعتی نسبت ابتلاء مردان به زنان در حدود 5 به 1 تا 6 به 1 و میزان گرفتاری در کودکان، خیلی کمتر از بزرگسالان گزارش گردیده است ولی در کشورهای در حال پیشرفته، این نسبت ها به هیچ وجه صدق نمی کند وتنها به دلیل رابطه شغلی مردان (مثل سلاخی و قصابی) تا حدودی در اینجنس بیشتر دیده می شود. براساس بررسی های اخیر در نقاط مختلف ایران، گروه سنی 19-15 ساله بیشتر از سایر گروه های سنی در معرض خطر مبتلا به بروسلوز قرار داشته و نسبت ابتلاء به بروسلوز در کودکان برخلاف گزارش های خارجی چندان کمتر از بزرگسالان نمی باشد و اختلاف فاحشی در توزیع جنسی بیماری نیز به چشم نمی خورد.
جدول شماره 4- پراکندگی جغرافیایی بروسلوز، در بین حیوانات
گونه های بروسلا میزان طبیعی محل انتشار
بروسلا آبورتوس
تیپ 6-1 و 9 گاو در تمام نقاط دنیا به استثناء نقاطی که بیماری را ریشه کن نموده اند نظیر ایرلند شمالی، بلژیک، دانمارک، نروژ، سوئد … ضمنا در انگلستان، آمریکا، کانادا، استرالیا و نیوزلند، اقدامات وسیعی در این زمینه انجام شده است.
بروسلا ملیتنسیس بز و گوسفند ایران، ترکیه، هند، سایر کشورهای آسیایی و آفریقائی، کشورهای حوزه مدیترانه، آمریکای مرکزی و جنوبی
بروسلاء سوئیس
تیپ 3و 1 خوک ایالات غربی آمریکا، آمریکای شمالی و مرکزی
تیپ 2 خوک و خرگوش دانمارک ، بخش هائی از اروپای مرکزی
تیپ 4 گوزن روسیه، آمریکای شمالی
تیپ 5 جوندگان شوروی سابق
بروسلا کانیس سگ آمریکا، ژاپن، آلمان، چکسلواکی سابق
بروسلا اویس گوسفند استرالیا، جنوب آفریقا، بخش هائی از آمریکای جنوبی، قسمت هائی از اروپای مرکزی
بروسلا نئوتومه موش جنگلی ایالات متحده آمریکا
توسعه اخیر صنایع دامپروری بدون استفاده از روشهای استاندارد و علمی و تداوم روشهای دامپروری سنتی، عادت های تغذیه سنتی به خصوص در مورد لبنیات از جمله عواملی هستند که در شیوع بیشتر بیماری نقش دارند. بروسلاها در شیر، ادرار، فضولات و بافتهای حیوانات مبتلا وجود دارند. شایعترین راه انتقال بیماری به انسان انتقال، از راه دستگاه گوارش از طریق مصرف شیر آلوده و یا فرآورده های خام و غیرپاستوریزه آن مثل پنیر تازه می باشد.
بروسلوز بیشتر در کسانی که شیر و لبنیات غیرپاستوریزه مصرف می کنند و یا با حیوانات سروکار دارند مانند کشاورزان، دامداران، چوپانها، دباغها، دامپزشکان، قصابها، کارکنان آزمایشگاه ها و صنایع بسته بندی دامی و کارگران کشتارگاهها مشاهده می شود.
در ضمن در فصول بهار و تابستان که در واقع فصول باروری و زایمان دامها است در اثر تماس مردم با بافتهای آلوده دامی مثل جفت های سقط شده حیوانی و تولید و مصرف بیشتر لبنیات تازه میزان بروز بیماری بیشتر است.
در حال حاضر بروسلوز انسانی، در کشورهای صنعتی، بیشتر در کارگران کشتارگاهها و قصابها مشاهده می شود در کشور ایران بیشترین میزان بروز بیماری در کشاورزان، دامداران و افرادی که از فرآورده های دامی غیرپاستوریزه استفاده می کنند مشاهده می شود . عامل بیماری برای انسان در ایران معمولا گونه ملیتنسیس است ولی با توجه به اینکه بروسلا آبورتوس نیز به فراوانی از گاوها در نقاط مختلف کشور جدا شده است بعید نیست که مواردی از بروسلوز ناشی از گونه آبورتوس نیز در بین ایرانیان بروز نماید که بعلت اشکالات تکنیکی آزمایشگاهی تشخیص داده نشده و یا بعلت خفیف بودن علایم بالینی چندان جلب توجه نمی کند.
گونه های های مختلف بروسلا در بین حیوانات ایران:
براساس مطالعاتی که طی سالهای 59-1350 در بخش بروسلوز انستیتورازی حصارک صورت گرفته نتایج زیر، حاصل شده است:
1) بروسلا آبورتوس جدا شده از حیوانات ایران، از بیوتیپ های 1 و 2 و 3و 4و 5 و 6 و 9 تشکیل شده بطوری که بیوتیپ 3 حالت آندمیک داشته و بعد از آن بیوتیپ های 5 و 9 از وفور بیشتری دارند.
2) بروسلا ملیتنسیس بیوتیپ 1 و 2 در موارد زیادی از گوسفندان و بزها و حتی از گاو و شتر نیز جدا شده است.
3) بروسلا سوئیس قبلا در خوک های ایران یافته می شد که عمدتا از بیوتیپ 1 و چند نمونه از بیوتیپ 2 بوده ولی در حال حاضر، مواردی مشاهده نمی شود.
4) بروسلا کانیس و اوویس تاکنون در ایران گزارش نشده است.
پیشگیری:
1) راه اساسی پیشگیری بروسلوز در انسان ریشه کن نمودن بیماری در دامها است برای اینکار بایستی حیوانات آلوده را با استفاده از آزمایشات سرمی وجلدی شناسایی و از حیوانات سالم جدا نمود.
واکسیناسیون حیوانات واجد شرایط: بطور کلی اگر شیوع عفونت در حیوانات یک منطقه حدود 5% باشد تنها واکسیناسیون توصیه می شود در صورتیکه شیوع کمتر از 1% باشد احتمالا اجرای یک برنامه ریشه کنی کوتاه مدت روش مناسبی باشد معمول ترین واکسنی که برای ایمن سازی گاوها بکار می رود سوش زنده ضعیف شده S19 بروسلا آبورتوس است یک تزریق واکسن حداقل برای 7 سال حیوان را محافظت می کند. برای ایجاد ایمنی در بز و گوسفند از واکسن تهیه شده از بروسلا ملیتنسیس ضعیف شده (موتان Rev-1) استفاده می شود واکسنهای Sev-1 و S19 در صورت تلقیح تصادفی، قادر به ایجاد عفونت در انسان هستند.
واکسن انسانی:
در سالهای اخیر فعالیت های جهت تهیه واکسن انسانی انجام یافته و درحال حاضر سوشهای خاصی از بروسلای زنده ضعیف شده به دلیل مطمئن بودن، ثبات و ایمنی زایی جهت واکسیناسیون در انسان بکار می روند. با توجه به ایمنی متقاطع بین گونه های مختلف بروسلا و به دلیل آنکه بیماریزایی بروسلا آبورتوس در انسان کمتر از گونه ملی تنسیسن است. سوشهای ضعیف شده ای از واریته های بروسلا آبورتوس (S19) و در برخی موارد سایر شوشهای آن انتخاب شده است.
در جمهوری های شوروی سابق، واکسیناسیون انسان با واکسن زنده بروسلا از سال 1952 در گروه های خاص از کارگران در معرض خطر (با آزمایش های سرولوژی و آزمون جلدی منفی) از طریق خراش پوستی یا تزریق زیرجلدی استفاده شده است. یک دوز واکسن (10 سلول باکتری) ایمن زا بوده و فرد را برای یک سال محافظت می کند در مناطقی که افراد واکسینه شده بودند میزان بروز بروسلوز انسانی 60% کاهش نشان داد. در مراحل بعدی می توان جهت تکرار واکسن از واکسن با دوز ضعیف (نصف دوز قبلی) استفاده شود لازم به یادآوری است که تلقیح مکرر واکسن زنده باعث بروز حساسیت می گردد. تاکنون حداقل دو نوع کمپلکس استخراجی از دیواره سلولی باکتری بروسلاها بعنوان آنتی ژن حفاظتی در انسان استفاده شده است که یکی آنتی ژن محافظت کننده بروسلوز (BPA)و دیگری کمپلکس غیرمحلول در فنل (PIF) می باشد.
واکسن BPA را با استفاده از اسید استیک یک دهم نرمال استخراج نموده و برای خالص نمودن بیشتر و حذف بافیمانده آندوتوکسین باکتری از اشعه گاما استفاده می شود. همچنین در این واکسن، پلی وینیل پیرولیدون بعنوان محرک ایمنی با اجونت بکار برده شده است.
واکسن BIF، عصاره ای از بروسلا آبورتوس S19 فاقد لیپید است که توسط سومارکوف و همکارانش تهیه شده است که کمپلکس غیرسمی بوده و در آزمایشات تجربی برای خوکچه هندی و موش محافظت کننده بوده است.
2) آموزش کلیاتی در باره بیماری و راه های پیشگیری از آن به افراد در معرض خطر و در مناطق آندمیک به عموم مردم
3) پاستوریزه کردن شیر، فرآورده های لبنی و بستنی
4) عدم استفاده از محصولات دامی خام، خودداری از دست زدن به لاشه حیوانات آلوده، استفاده از وسایل محافظتی نظیر دستکش و عینک در تماس های شغلی
5) آموزش روحانیون و معلمین محلی و اخذ کمک از آنها به منظور ارتقاء آگاهی های افراد بومی نسبت به عوارض بیماری و راههای پیشگیری از آن
6) بیمه کردن دامهای روستائیان و دامداران و تحویل دام های سالم در مقابل اخذ دام های آلوده آنها یا پرداخت غرامت متناسب به آنان
7) تشخیص و درمان به موقع بیماران به منظور جلوگیری از بروز عوارض جدی و مزمن شدن بیماری
8) در صورت بروز عوارض خطیری مانند گرفتاری ستون مهره ها، استئومیلیت بایستی با دارو درمانی یا انجام جراحی مناسب، از پیشرفت بیماری و بروز عوارض زمین گیر کننده جلوگیری نمود.
9) در موارد بروز طغیان یا همه گیری باید کانون آلودگی را شناسایی و آن را از بین برد.
درمان: (فقط جهت مطالعه)
اهداف اصلی درمان ضدمیکروبی در بروسلوز شامل درمان عفونت فعلی و بهبود علایم آن و نیز جلوگیری از عود بیماری است. بیماری موضعی ممکن است به مداخلات جراحی (مثل تعویض دریچه قلبی، درناژ آبسه و جایگزینی مفصل است) و درمان آنتی بیوتیکی طولانی مدت تر نیاز داشته باشد. بعلاوه، سل باید همیشه رد شود یا رژیم درمانی به نحوی انتخاب شود که از درمان تک دارویی با عوامل فعال علیه سل (مانند ریفامپین) جلوگیری شود یا یک رژیم ضدسلی کامل تجویز شود.
بیماران مبتلا به بروسلوز، تا زمانی که تب دارند باید در بستر استراحت کنند و در صورت وخامت بیماری لازم است در بیمارستان بستری گردند ولی در غیراینصورت میتوان آنها را بطور سرپایی تحت درمان قرار داد. در صورت وجود سوء تغذیه بایستی کربوهیدرات و ویتامین های بیشتری در رژیم غذایی آنها گنجانده شود ولی بطوری کلی، رژیم غذایی در این بیماران، آزاد می باشد.
در صورت وجود دهیدراتاسیون باید از مایعات و الکترولیت های وریدی مناسبی استفاده نمود و ضمنا باید به بیماران و خانواده آنها اطمینان داد که بروسلوز بیماری قابل درمانی است و بهبودی بالینی و باکتریولوژیک، حاصل خواهد شد.
به منظور تسکین سردرد، کمردرد و دردهای عمومی ناشی از بروسلوز، مصرف داروهای مسکن بلامانع است و تجویز ملین در موارد وجود یبوست شدید و داروهای آرامبخش در موارد بیخوابی و بیقراری و امثال آن منع نشده است (برخلاف تیفوئید).
بروسلاها پاتوژن های داخل سلولی هستند و داروهائی که در خارج بدن به خوبی بر آنها موثر واقع
می شود ممکن است در بدن بنحو مطلوبی با آنها تماس پیدا نکند و بنابراین جهت ریشه کن نمودن این ارگانیسم ها باید به درمان دراز مدت، اقدام نمود.
بیمارانی که بوسیله یک دارو به تنهایی نظیر تتراسیکلین، استرپتومایسین، ریفامپیسین یا کوتریموکسازول درمان شده اند در 40-10% موارد دچار عود بروسلوز، گردیده اند و لذا نظر بسیاری از محققین بر اینست که بروسلوز را باید با ترکیبی از چند آنتی بیوتیک، درمان نمود. در برخی مطالعه های ذکر شده است که افرادی که به عفونت بدون گرفتاری CNS یا آندوکاردیبت مبتلا شده اند درمان حاوی استرپتومایسین عود کمتری نشان داده است.
قبلا سازمان جهانی بهداشت، تتراسایکلین 2 گرم در روز بمدت 6 هفته + استرپتومایسین 1 گرم در روز به مدت 3 هفته راتوصیه می نمود و هنوز بعضی از منابع، آن را رژیم انتخابی، معرفی نموده تاثیر داکسی سیکلین به مقدار 100 میلی گرم در 12 ساعت را همانند تتراسایکلین، دانسته اند. این داروها در سطح وسیعی مورد استفاده قرار گرفته و میزان عود ناشی از آن ها در سطح پائینی قرار دارد ولی تزریق عضلانی استرپتومایسین، استفاده از این رژیم درمانی را در بعضی از موارد مشکل می نماید و لذا در حال حاضر Doxycycline به مقدار 200 میلی گرم در روز + ریفامیسین 600 میلی گرم در روز به مدت شش هفته بوسیله WHO بعنوان رژیم دارویی انتخابی، معرفی شده است و برخی از محققین متعقدند که درمان فوق در صورت وجود عوارض چرکی کاونی، به مدت بیش از شش هفته تجویز گردد.
رژیم هائی که بمنظور درمان بروسلوز حاد بدون عارضه مورد استفاده قرار می گیرد ممکن است در مبتلایان به گرفتاری CNS به خاطر پائین بودن سطح تتراسیکلین و استرپتومایسین، در مایع نخاع، منجر به عود بیماری گردند و لذا ترکیبی از ریفامپیسین به اضافه سفالوسپورین های نسل سوم را می توان دراین بیماران تجویز نمود. زیرا این داروها در مایع نخاع از سطح خوبی برخوردار می باشند. همچنین برخی از محققین، ترکیب تتراسیکلین یا داکسی سیکلین به اضافه ریفامپیسین را مناسب دانسته اند ولی تجارب بسیار اندکی در رابط با مصرف این داروها وجود دارد و اینکه آیا مصرف آنها در مبتلایان به بروسلوز عصبی، موارد عود کمتری به دنبال خواهد داشت یا نه نیازمند بررسی بیشتری می باشد.
آندوکاردیت بروسلائی را می توان با سه داروی باکتریسید نظیر استرپتومایسین، کوتریموکسازول و ریفامپسین بنحوی که در مورد مننژیت بروسلائی ذکر شد درمان نمود.
البته مبتلایان به آندوکاردیت بروسلائی تقریبا همیشه نیاز به درمان آنتی بیوتیکی همراه با تعویض دریچه دارند و در مورد تاثیر درمان آنتی بیوتیکی به تنهائی و دوره درمانی، نظر واحدی وجود ندارد ولی درمان باترکیب تتراسایکلین، استرپتومایسین و کوتریموکسازول، به مدت شش هفته یا ریفامپیسین و کوتریموکسازول به مدت 6-9 ماه، با موفقیت، مورد استفاده قرار گرفته است.
درمان بروسلوز در زنان حامله:
با توجه به اینکه طی بیماری بروسلوز، ممکن است سقط با زایمان زودرس ناشی از شدت بیماری یا هر علت دیگری عارض شود در زنان حامله حتی هنگامی که بیماری با علائم مختصری تظاهر نموده است باید به سرعت و بنحو موثری آنرا تحت کنترل در آورد. البته گرجه اثرات سوء تتراسایکلین در حاملگی به اثبات رسیده است و مصرف استرپتومایسین نیز ممنوع می باشد ولی شواهدی دال بر اثرات سوء کوتریموکسازول و ریفامپیسین، در جنین انسان، موجود نمی باشد بنابراین می توان این داروها را در دوره حاملگی، تجویز نمود. قابل ذکر است که با توجه به اثرات ثابت شده سولفامیدها طی چند روز آخر باردار که بر خطر بروز Kernicterus می افزاید صلاح است در 2-3 هفته آخر حاملگی از مصرف این دارو نیز خودداری شود و تا آخر حاملگی از ترکیب ریفامپیسین و جنتامایسین با مقادیر ذکر شده قبلی استفاده گردد و سپس رژیم مناسبی نظیر کوتریموکسازول و ریفامپیسین جایگزین آن شود.
درمان بروسلوز در اطفال:
در درمان بروسلوز اطفال، تتراسیکلین به مقدرا 20-40 میلی گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن در روز و داکسی سایکلین به مقدار 2-4 میلیکرم و به مدت شش هفته موثر واقع می شود ولی در کودکان کمتر از 9 ساله به دلیل رنگی شدن غیرقابل برگشت دندان های شیری نباید از این داروها استفاده شود. ضمنا طی مطالعه ای مشخص شده است که ترکیب تتراسیکلین و استرپتومایسین، در بروسلا ها خاصیبت باکتریسید داشته در حالیکه هر یک از آنها به تنهائی دارای خاصیت باکتریواستاتیک بوده است و جنتامایسین یا توبرامایسین، موثر تر از استرپتومایسین، ذکر شده است.
کوتریموکسازول را می توان در کودکان به مقدار 8-10 میلی گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن برحسب تریمتوپریم تجویز نمود و به مدت شش هفته ادامه داد و از ریفامپیسین و سایر آنتی بیوتیکهای موثر بر بروسلا ها نیز با موفقیت استفاده شده و توصیه گردیده است در صورتی که با تجویز استرپتومایسین به اضافه تتراسیکلین یا کوتریموکسازول، پاسخ ضعیفی دریافت شود استفاده کرد و همچنین در مننژیت و آندوکاردیت، بروسلائی، ریفامپیسین نیز به داروهای مزبور، افزوده گردد.
به منظور جلوگیری از عود بروسلوز ناشی از گونه ملیتنسیس، پیشنهاد می شود درک ودکان ایرانی، از ترکیب ریفامپیسین و کوتریموکسازول و در سنین بالاتر از 9 سالگی از همان رژیمهای درمانی بزرگسالان با دوز اطفال، استفاده نمائیم.
آنتی بیوتیک هایی که مصرف آنها در درمان بروسلوز، توصیه نشده است:
بررسیهای آزمایشگاهی، حاکی از آنست که بروسلا ها معمولا نسبت به مواد دیگری نظیر Imipenem و Ciprofloxacin نیز حساسند ولی مصرف داروهائی نظیر پنی سیلین، سفالوسپورین ها، کلرامفنیکل، تووبیوسین، سیکلوسپورین، اریترومایسین، پلی میگزین ها و سولفانامیدها توصیه نشده است درمان باترانسفوزیون خون، سرم ایمنی دهنده (Serum immune) واکسنهای بروسلا و فاژهای بروسلا و لوامیزول و سایر موادی که ادعا شده است باعث افزایش پاسخ ایمنی، می گردد قابل توصیه نمی باشد و از آنجا که تجویز سیپروفلوکساسین، بنحو شایعی منجر به عود، شده است مصرف این دارو نیز توصیه نمی شود.
آزمایش ویدال (Widal test):
مقدمه:
آزمایش ویدال برای تشخیص سرولوژی بیماری حصبه (Typhoid) و شبه حصبه (Paratyphoid) می باشد که علت آنها آلودگی با باسیلهای گونه سالمونلا (Salmonella) از دسته باسیلهای روده ای (Enteric bacilli) می باشد. این باسیلها از راه دستگاه گوارش وارد بدن انسان می شوند و موجب پیدایش بیماریهای مهم زیر می گردند:
1- تبهای تیفوئیدی و پاراتیفوئیدی که بنام تبهای روده ای (Enteric fever) معروف است.
2- سپتیسمی و عفونت خون (Septicemia).
3- مسمویتهای غذائی.
باسیلهای تیفوئید و پاراتیفوئید را می توان قبل از این که تست ویدال مثبت شود بترتیب از خون، مدفوع و سپس ادرار جدا کرد. بتدریج که تیتر آنتی بادی بالا می رود کشتهای مثبت میکروب نیز کمتر می شوند طبق آمار گزارش شده تنها 50 درصد بیمارانی که مبتلا به
تب روده ای می شوند آزمایش ویدال آنها یک هفته بعد از ورود میکروب به بدن مثبت
می شود، در صورتی که چهار هفته بعد، 90 تا 95 درصد بیماران آزمایش ویدال آنها مثبت خواهد شد.
آزمایش کلاسیک ویدال اولین بار در سال 1896 توسط ویدال (Widal) دانشمند فرانسوی به مجموع پزشکان بیمارستانهای پاریس ارائه شد. در ازمایش کلاسیک ویدال خود میکروب بعنوان آنتی ژن بکار می رفت و فقط آنتی بادی برعلیه فلاژله های میکروب (Flagella) یا آنتی ژن H اندازه گیری می شد. پیرو مطالعات فلیکس (Felix)، آنتی ژنهای ساختمانی، بدنی یا سوماتیک O در میکروبهای گروه سالمونلا شناخته شده و نقش این آنتی ژنها در بیماریزائی میکروب نشان داده شد. بهمین دلیل وجود آنتی بادی بر علیه آنتی ژن O در سرم بیمار از نظر تشخیص کلینیکی ارزش زیادی دارد. در شکل شماره 1-6 ، زمان ظهور آنتی کرهای H,O و Vi در رابطه با تیتر سرم بیمار نشان می دهد. آنتی ژن H از جنس پروتئین و آنتی کر ضد آن بیشتر از کلاس IgG است، در صورتیکه ساختمان آنتی ژن O بیشتر از جنس لیپوپلی ساکارید (LPS) و آنتی کر ضد آن معمولا IgM می باشد. بنابراین پس از درمان بیماری حصبه، آنتی –O در مدت سه ماه تا حداکثر 6 ماه منفی می شود، ولی آنتی –H تا مدتها مثبت باقی می ماند و در بررسی های همه گیر شناسی عفونتهای سالمونلائی ارزش دارد. نیمه عمر IgM حدود 5 روز و IgG بین 21 تا 23 روز است.
آزمایش تکمیلی و تفکیکی تشخیص آگلوتی نین های H, O بیماری حصبه که امروزه متداول است در فرانسه بنام ویدال – فلیکس، در ایران و بعضی کشورهای دیگر ویدال و در آلمان و اتریش بنام گروبر – ویدال (Grieber-Widal) خوانده می شود.
علاوه بر دو آنتی ژن ذکر شده، آنتی ژن دیگری از دسته آنتی ژنهای سطحی
(Surface antigen) یا کپسولی، در اطراف آنتی ژن O بنام آنتی ژن
Vi- (a virulence-asociated capsular antigen) از جنس پلی ساکارید در باسیلهای سالمونلاتیفی (S.typhi) و سالمونلاپارا-سی (S-para-C_ دیده شده است. آنتی بادی بر علیه این آنتی ژن از کلاس IgM است و دیرتر از آگلوتی نین های H, O در خون بیمار ظاهر شده و سرعت نیز از بین می رود.
آزمایشهای فیبریل برای تشخیص بیماریهای تب دار بر اساس آگلوتیناسیون فعال یا مستقیم و جستجوی آگلوتینینها در سرم می باشند. این آزمایشها به دو طریقه سریع بر روی لام و بطئی در لوله انجام می شوند. روش غربالی (Screening method) روی لام برای یک بررسی اجمالی سرمها و جداکردن نمونه ها می باشد. چنانکه در روش بر روی لام سرمی مثبت کاذب و یا به عللی که قبلا ذکر شد منفی کاذب باشد باید آزمایش را با روش لوله تکرار نمود تا تیتر یا عیار واقعی آنتی بادی معلوم شود. بطور کلی روش لوله ای دقیق تر و با ارزشتر از روش سریع روی لام است.
مواد و وسایل لازم برای انجام آزمایش:
الف – سرم بیمار : سرم بیمار را معمولا بدون از بین بردن کمپلمان آن بکار می برند، زیرا گاه حرارت باعث پائین آوردن تیتر آگلوتینینهای سرم می شود. سرم باید فاقد هرگونه ذرات و همولیز باشد اگرذراتی از خود سرم و یا از خارج در آن دیده شود باید قبل از آزمایش، سرم را از صافی عبور داد و با دور زیاد سانتریفیوژ کرد تا ذرات آن گرفته شود.
ب – آنتی ژن – موسسات مختلف تولید مواد بیولوژیکی آزمایشگاهی داخلی و خارجی، آنتی بادیهای آزمایشهای فیبریل را تولید می نمایند. در سالهای اخیر انستیتوپاستور ایران و موسسه رازی حصارک مقادیر قابل توجهی از این آنتی ژن ها را برای مصارف داخلی تهیه می کنند. این آنتی ژنها رنگی
می باشند که از مواد رنگی مانند کریستال ویوله (کریستال بنفش) Crystal violetو سبز درخشان استفادهشده است. تعداد میکروب در هر سانتی متر مکعب محلول آنتی ژن، استاندارد
می باشد، بنابراین هنگام مصرف باید شیشه آنتی ژن را به آرامی حرکت داد تا ذرات آنتی زن بصورت سوسپانسیون یکنواخت درآید در صورتیکه پس از تکان دادن شیشه، محلول یکنواختی حاصل نشد و توده های درشت بهم چسبیده مشاهده شد، از بکار بردن آن شیشه آنتی ژن باید صرف نظر کرد. محلولهای آنتی ژن دارای موادی مانند فنل یا فرمالین می باشند و همیشه باید شیشه های محتوی آنتی ژن در یخچال 2 تا 8 درجه نگهداری شوند و هیچوقت نباید دچار یخ زدگی شوند. قبل از انجام آزمایش باید شیشه های محتوی آنتی ژن را از یخچال بیرون آورد تا قدری گرم شده و به درجه حرارت محیط آزمایشگاه برسند. هنگام باز کردن شیشه های آنتی ژن، باید مراقب بود تا آنتی ژن آلوده نشود. هیچوقت محتوی چند شیشه آنتی ژن را مخلوط نکنید.
برای آزمایش ویدال از آنتی ژنهای سوماتیک O و فلاژله H میکروبهای زیر استفاده می شود:
1- سالمونلا تیفی (گروه دی) S.typhi (group D)
2- سالمونلا پاراتیفی آ (گروه آ) S.paratyphi A(group A)
3- سالمونلا پاراتیفی بی (گروه بی) S.paratyphi B(group B)
4- سالمونلا پاراتیفی سی (گروه سی) S.paratyphi C(group C)
آنتی ژنهای سوماتیک O رابا حروف بزرگ D,C,B,A و غیره و آنتی ژنهای فلاژله را کوچک c,b,a و d نشان می دهند. مثلا آنتی ژنهای D و d بترتیب مربوط به آنتی ژنهای میکروب سالمونلاتیفی
می باشند.
ج – سرمهای کنترل – بهتر است در هر آزمایش یک سرم کنترل مثبت و یک سرم کنترل منفی همراه با سرم بیمار آزمایش شود تا در صورتیکه آنتی ژن دچار تغییراتی شده باشد معلوم شود.
د – سرم فیزیولوژی – غلظت سرم فیزیولوژی برای رقیق کردن سرم، معمولا محلول 5/8 گرم کلرور سدیم در یک لیتر آب مقطر می باشد.
ه – وسایل مورد نیاز – چهار صفحه شیشه ای بطول و عرض تقریب 15*18 سانتی متر که بوسیله قلم الماس یا مداد شمعی هر کدام از آنها به 30 مربع به طول 3 سانتی متر تقسیم شده اند. لوله های آزمایش سرولوژی به قطر و طول 75*12 میلی متر به تعداد کافی، پیپت سرولوژی مدرج به حجمهای 1/0 و 2 سانتی متر مکعب به تعداد لازم، اپلیکاتور چوبی یا پلاستیکی، جالوله ای، چراغ مطالعه، حمام بن ماری Wather bath و روتاتور Rotator. لازم به تذکر است که وسایل آزمایشهای سرولوژی باید عاری از هرگونه آلودگی باشند ولی احتیاجی به استریل بودن آنها نیست.
روش انجام متد سریع برروی لام (Rapid slide test):
1- ابتدا از سرم بیمار با یک پیپت 1/0 سانتی متر مکعب از سمت چپ بطرف راست بترتیب در هر یک از مربعهای روی صفحه شیشه ای ردیف اول و دوم مقادیر 08/0 ، 04/0، 02/0، 01/0، و 005/0 سانتی متر مکعب ریخته شود.
2- همین مقادیر از سرم مثبت را در ردیف های سوم و چهارم و از سرم منفی در ردیف های پنجم و ششم بزنید.
3- شیشه های آنتی زن را قبل از شروع آزمایش از یخچال بیرون آورده تا به حرارت محیط آزمایشگاه برسند سرم هر بیمار باید حداقل با آنتی ژنهای O و H سه میکروب سالمونلا گروه B,A و D آزمایش شود. هر صفحه شیشه ای برای آنتی ژنهای O و H یک میکروب در نظر گرفته شوند و بدین ترتیب در ردیف های یک ، سه و پنج یک قطره (یا 03/0 میلی لیتر)
آنتی ژن O و در ردیف های دو، چهار و ششم یک قطره (یا 03/0 میلی لیتر) آنتی ژن H در هر مربع و در کنار قطره سرم قرار داده شود. لازم به تذکر است در شرایطی که چندی سرم بیمار در یک زمان آزمایش می شوند، سرمهای کنترل مثبت و منفی فقط یکبار آزمایش شوند.
4- آنتی ژن و سرم را در هر مربع با اپلیکاتور مخلوط کرده و به اندازه دایره ای بقطر حدود 5/2 سانتی متر پهن نمایید. برای اینکار در هر ردیف رقتهای یک سرم از یک اپلیکاتور جداگانه استفاده شود و از مقادیر کمتر بطرف مقادیر بالاتر (از سمت راست بطرف چپ) سرم و آنتی زن را مخلوط نموده و سپس اپلیکاتورها را دور بریزید.
5- صفحه شیشه ای را به آرامی حداکثر بمدت سه دقیقه در دست یا روی روتاتور حرکت دهید.
6- نتیجه آگلوتیناسیون هر رقت سرم را در یر نور غیرمستقیم چراغ و در بالای یک صفحه تیره بطور ماکروسکوپی بصورت زیر یادداشت نمائید.
الف – در صورتی که صددرصد میکروب آگلوتینه شود بصورت +4 یادداشت شود.
ب – در صورتی که 75 درصد میکروب آگلوتینه شود بصورت +3 یادداشت شود.
ج – در صورتی که 50 درصد میکروب آگلوتینه شود بصورت +2 یادداشت شود.
د – در صورتی که 25 درصد میکروب آگلوتینه شود بصورت +1 یادداشت شود.
ه – در صورتی که کمتر از 25 درصد میکروب آگلوتینه شود بصورت ± یادداشت شود.
و – در صورتی که هیچ آگلوتیناسیونی مشاهده نشود بصورت منفی یادداشت شود.
اگر چه روش روی لام برای محاسبه عیار با تیتر بیمار روش دقیقی نمی باشد، ولی می توان بطور تقریبی تیتر نهائی (Endpoint titer) سرم را بدست آورد. بالاترین رقتی از سرم که 50 درصد (+2) میکروب را آگلوتینه نماید، تیتر سرم می باشد.
حجم سرم در هر مربع روی شیشه بطور تقریبی معادل تیترهای زیر در روش لوله می باشد:
تیتر تقریبی سرم حجم سرم
1:20 08/0 میلی لیتر
1:40 04/0 میلی لیتر
1:80 02/0 میلی لیتر
1:160 01/0 میلی لیتر
1:320 005/0 میلی لیتر
نکته: نتیجه آگلوتیناسیون برروی لام باید بلافاصله بعد از سه دقیقه خوانده شود. بعد از این مدت، بعلت خشک شدن آنتی ژن و آنتی بادی بر روی شیشه و بهم چسبیدن مولکولهای آنتی ژن (Aggregation) ممکن است بطور کاذب آزمایش مثبت شود.
روش انجام متد بطئی در لوله (Tube test):
1- 11 لوله آزمایش سرولوژی را در جالوله ای مناسب قرار دهید. اگر انتهای لوله های آزمایش مخروطی شکل باشند، آگلوتیناسیون واضح تر دیده می شود.
2- در لوله اول 9/0 میلی لیتر و به لوله های بعدی 5/0 میلی لیتر سرم فیزیولوژی بریزید.
3- در لوله اول 1/0 میلی لیتر سرم بیمار را اضافه کنید. پس از مخلوط کردن با سرم فیزیولوژی مقدار 5/0 میلی لیتر از آنرا به لوله دوم منتقل نمائید. پس از مخلوط کردن در لوله دوم مقدار 5/0 میلی لیتر از آنرا به لوله سوم منتقل نموده و سپس این کار را تا لوله دهم ادامه دهید (جدول شماره 1-6)
از لوله دهم مقدار 5/0 میلی لیتر را پس از مخلوط کردن بدور بریزید. بدین ترتیب حجم نهائی سرم رقیق شده در تمام لوله ها 5/0 میلی لیتر است.
4- لوله شماره 11 بعنوان کنترل آنتی ژن است و فاقد سرم بیمار می باشد.
5- برای سرم کنترلهای مثبت و منفی نیز می توانید برای هرکدام ده لوله آزمایش درجالوله ای قرار داده و مانند سرم بیمار روی آن عمل نمائید.
6- به تمام لوله های ازمایش مقدار 5/0 میلی لیتر آنتی ژن مورد نظر اضافه نمائید.
یادآوری می شود آنتی ژنی که برای روش لوله بکار برده می شود باید مطابق دستور موسسه سازنده آنتی ژن یا سرم فیزیولوژی رقیق شود. غلظت ذرات آنتی ژن در روش لوله از روش روی لام، کمتر است.
7- جالوله ای راهمراه با لوله های آزمایش به آرامی تکان دهید تا سرم و آنتی ژن بخوبی مخلوط شوند. سپس لوله ها را در حرات 45 تا 52 درجه سانتیگراد در حمام بن ماری (Water Bath) قرار دهید. لوله هائی که حاوی آنتی ژن O می باشند بمدت 18 تا 24 ساعت و لوله هائی که حاوی آنتی ژن H می باشند بمدت یک تا دو ساعت در بن ماری قرار دهید.
8- پس از مدت زمان معین، جالوله ای ها را با احتیاط از بن ماری در آورده، بطوری که رسوب پائین لوله ها تکان نخورند.
ابتدا نتیجه لوله های شاهد آنتی ژن و کنترل سرم را خوانده و سپس لوله های سرم بیمار را یکی یکی بترتیب از جالوله ای خارج نموده و در زیر نور غیرمستقیم چراغ و در بالای یک صفحه تیره مورد بررسی قرار دهید. برای رویت بهتر آگلوتی ناسیون می توان از یک ذره بین دستی یا آینه میکروسکوپ های قدیمی استفاده کرد. در ابتدا درجه شفافیت محلول بالای لوله آزمایش را باید در نظر گرفت و سپس به آرامی به ته لوله ضربه ای زده شود تا رسوب ته آن حرکت کند. آگلوتیناسیون آنتی ژن سوماتیک O باکندی صورت گرفته و معمولا بصورت رسوبی کوچک فشرده (Clump) و ظاهرا دانه دانه (Granular) دیده می شود که پس از تکان دادن آرام لوله و جابجا شدن، متلاشی نمی شود و دوباره به وضع اولیه بر می گردد. آگلوتیناسیون آنتی ژن فلاژله H سریع و بصورت رسوبی درشت، فلوکولار (Floccular) و ظاهرا شبیه گلوله برفی (Fluffy) به نظر می رسد که در اثر تکان لوله از هم پاشیده می شود.
نتیجه آزمایش را در تک تک لوله ها بصورت زیر خوانده و یادداشت نمائید:
الف – چنانکه تمام آنتی ژن موجود در لوله آگلوتینه شده ومایع بالای رسوب کاملا شفاف باشد جواب را بصورت +4 یادداشت نمائید.
ب – اگر تقریبا 75 درصد آنتی ژن موجود در لوله آگلوتینه شده و مایع بالای رسوب نسبتا کدر باشد جواب بصورت +3 یادداشت شود.
ج – چنانکه تقریبا 50 درصد آنتی ژن موجود در لوله آگلوتینه شده ومایع بالای رسوب نسبتا کدر باشد، جواب را بصورت +2 یادداشت نمائید.
د – اگر تقریبا 25 درصد آنتی ژن موجود در لوله آگلوتینه شده ومایع بالای رسوب کدر باشد جواب را بصورت 10 یادداشت نمائید.
ه – چنانکه هیچ رسوبی در ته لوله مشاهده نشد و مایع لوله کاملا مانند شاهد آنتی ژن کدر باشد جواب آزمایش منفی می باشد.
جدول 1-6- راهنمای انجام آزمایش ویدال به روش بطئی در لوله
11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 شماره لوله
5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 9/0 سرم فیزیولوژی (میلی لیتر)
– 1/0 سرم بیمار (میلی لیتر)
– 5/0
به دور بریزید 5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 سرم رقیق شده (میلی لیتر)
5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 5/0 آنتی ژن (میلی لیتر)
شاهد 1:10240 1:5120 1:2560 1:1280 1:640 1:320 1:160 1:80 1:40 1:20 رقت یا تیتر نهائی سرم
تیتر نهائی سرم، رقتی از سرم است که جواب آن لوله حداقل +2 یا 50 درصد آنتی ژن، آگلوتینه شده باشد.
چه تیتری از سرم ارزش دارد؟
معمولا در تبهای تیفوئیدی و پاراتیفوئیدی آگلوتینینهای O از حدود روز هشتم و آگلوتینینهای H از حدود روز دهم تا دوازدهم بتدریج در خون ظاهر می شوند. بنابراین اگر در هفته اول بیماری، سرم بیمار مورد آزمایش ویدال قرار گرفت و نتیجه آن منفی بود، در آزمایش مجدد چند روز بعد، احتمالا مثبت خواهد شد. در ابتدای بیماری، تیتر آگلوتینین O بیشتر از H می باشد ولی پس از چند روز تیتر H بسرعت بالارفته و از O بیشتر می شود.
حداقل تیتر قابل قبول و با ارزش آگلوتی نینها در آزمایش ویدال در کشورهای مختلف متفاوت است. درایران چنانکه تیتر سرم بیمار در برابر آنتی ژن سوماتیک O حداقل 1:80 و در برابر آنتی ژن فلاژله H حداقل 1:40 باشد، بیمار مشکوک به تیفوئید و یا پاراتیفوئید است.در صورتیکه آگلوتی نین O 1:160 و آگلوتی نین H 1:80 و یا بیشتر باشد، بیمار با توجه به علائم بالینی و وضعیت اپیدمیولوژی محیط به بیماری تیفوئید و یا پاراتیفوئید مبتلا می باشد. یادآوری می شود، آگلوتی ناسیون H بتنهائی ارزش تشخیصی ندارد، در صورتیکه آگلوتی ناسیون قابل قبول O، دلیل بر بیماری می باشد تیتر آگلوتی نین O بندرت از 1:400 بالاتر می رود و پس از بهبودی در عرض سه ماه تا حداکثر 6 ماه به صفر می رسد ولی تیتر آگلوتی نین H از 1:1000 بالاتر رفته و سالها پس از بهبودی مثبت باقی
می ماند.
آگلوتی نین Vi در اواخر هفته دوم بعد از آگلوتی نین H در سرم بیمار ظاهر شده وتیتر آن حداکثر از 1:25 تا 1:50 بالاتر نمی رود و پس از بهبودی سریعا در سرم ناپدید می شود در حاملین سالم تیتر آگلوتی نین Vi بیش از O و H می باشد که با کشت مکرر مدفوع و جداکردن میکروسکوپ می توان آنها را شناسائی و درمان کرد.
نکته: جواب آزمایش روی لازم ممکن است با جواب آزمایش لوله مطابقت نداشته باشد بعبارت دیگر آزمایش ویدال بطریقه لوله، تائیدی است برای روش روی لام که بوسیله روش لوله می توان جواب واقعی و قطعی را بدست آورده و در نتیجه موارد مثبت و منفی کاذب را که در روش روی لام ممکن است پدید آید از یکدیگر متمایز نمود.
تفسیر نتایج آزمایش ویدال:
برای روشن شدن مطلب، نتایج مختلفی از آزمایش ویدال که ممکن است توسط آزمایشگاه گزارش شود در جدول شماره 2-6 مورد مطالعه وتفسیر قرار داده می شوند.
آنتی ژن 1 2 3 4 5 6 7
D 1:400 1:200 1:200 1:100 – 1:400 –
D 1:800 – – – 1:400 1:600 1:200
A – – – – – – –
A – – – – 1:100 1:100 –
B – 1:400 – 1:200 – – –
b – 1:800 – – 1:200 1:200 –
مثال یک – جواب آزمایشگاه مثلا اینست، آزمایش با آنتی ژن D به نسبت 1:400 و با
آنتی ژن d به نسبت 1:800 مثبت و با بقیه منفی شده است (ستون 1جدول).
تفسیر این مورد خیلی آسان است و وجود بیماری حصبه در نتیجه باسیل سالمونلاتیفی (S.typhi) را در حالت استقرار نشان می دهد، زیرا که در این بیماری آنتی بادی در مقابل هر دو آنتی ژن O و H بمقدار قابل توجهی برای تشخیص بیماری تیفوئید وجود دارد. نظیر این مورد مثلا آزمایشی است که با آنتی ژن B به نسبت 1:200 و با b به نسبت 1:400 مثبت باشد. تفسیر آن یک بیماری شب حصبه در نتیجه میکروب سالمونلاپاراتیفی بی (S.paratyphi B) می باشد.
مثال دو – جواب آزمایشگاه مثلا اینست، آزمایش با آنتی ژنهای D به نسبت 1:200 و با B به نسبت 1:400 و با b به نسبت 1:8000 مثبت ولی با بقیه منفی می باشد (ستون 2جدول).
تفسیر این مورد یک تب شبه حصبه در نتیجه باسیل سالمونلا پاراتیفی بی می باشد که عامل بیماری با باسیل سالمونلا تیفی آنتی ژن مشترک O دارد و به همین علت است که تیتر آنتی D هم به نسبت با ارزشی مثبت شده است.
مثال سه – جواب آزمایشگاه مثلا بدین قرار است، آزمایش با آنتی ژن D به نسبت 1:200 مثبت و با بقیه منفی گردیده است (ستون 3 جدول). این مورد آزمایش را بصورتهای مختلف زیر می توان تفسیر کرد:
الف – بیمار مبتلا به حصبه در روز هفتم تا دهم بیماری می باشد. در این وضعیت چون
آنتی بادی بر علیه آنتی ژن O زودتر بوجود می آید لذا آزمایش در مقابل آنتی ژن O مثبت شده است. در این مورد باید پس از چند روز آزمایش را تکرار کرد تا در صورتی که تیتر آنتی بادی بر علیه آنتی ژن O افزایش نشان دهد و آنتی بادی ضد H نیز در سرم مثبت شده باشد در اینصورت حدس ما صحیح است.
ب – ممکن است عفونت ناشی از سالمونلائی باشد که دارای آنتی ژن مشترک O با باسیل ابرت (آنتی ژن D) است، ولی آنتی ژن H آنها متفاوت می باشد. درا ین صورت اگر آزمایش با آنتی ژن H چنین سالمونلائی انجام شود، نتیجه مثبت خواهد شد. در عفونتهای ناشی از سالمونلاانتریتیدیس (S.enteritidis) چنین حالتی زیاد مشاهده می شود.
ج –ممکن است شخص مبتلا به عفونت با باسیل Yersinia pseudotuberculosis
(Malassez-Vignal type IV) باشد که با آنتی ژن O باسیل ابرت (آنتی ژن D) تشابه آنتی ژن دارد.
د – در موارد خیلی نادر (یک مورد از 163 نمونه) ممکن است عفونت حصبه ای باشد که ناشی از باسیل ابرتی است که آنتی ژن H ندارد.
مثال چهار – جواب آزمایشگاه مثلا بدین قرار است، آزمایش با آنتی ژنهای D به نسبت 1:100 و با B به نسبت 1:200 مثبت و با بقیه منفی است (ستون 4 جدول). در تفسیر این وضعیت، احتمالات زیر را باید در نظر گرفت:
الف – شخص مبتلا به پاراتیفوئید بی در اوائل هفته دوم است در حالیکه میکروب با باسیل ابرت اشتراک آنتی ژنی (آنتی ژن D) دارد.
ب – شخص ممکن است مبتلا به عفونت سالمونلائی باشد که آنتی ژن O مشترک با سالمونلا پاراتیفی بی (آنتی ژن B) و سالمونلاتیفی (آنتی ژن D) دارد. در این مورد باید بفکر سالمونلاتیفی موریوم (S.typhi-murtium) افتاد.
ج – ممکن است شخص مبتلا به عفونتی در نتیجه باسیل Yersiniapseudotuberculosis
(Malassez-Vignal type II) باشد که این میکروب آنتی ژن مشترک O با باسیل پاراتیفوئید بی دارد.
د – درموارد نادری ممکن است شخص مبتلا به عفونتی ناشی از سالمونلاپاراتیفی بی باشد که فاقد آنتی ژن H است.
مثال پنج – آزمایش ویدال شخصی با آنتی ژن H سه میکروب باسیل ابرات، باسیل پاراتیفی T و باسیل پاراتیفی بی به نسبت قابل ارزش مثبت و با بقیه منفی شده است (ستون 5 جدول):
این مورد در افرادی دیده می شود که باواکسن این سه باسیل (T.A.B) بیش از سه ماه قبل واکسینه شده اند. چنانچه در ستون پنج ملاحظه می شود تیتر آنتی بادی بر علیه آنتی ژن a از سایرین کمتر و حتی ممکن است در بعضی موارد منفی باشد. علت این موضوع آنست که میکروب سالمونلاپاراتیفی T از نظر آنتی ژنیک بسیار ضعیف است. معمولا بیشتر در افراد مسن آگلوتینینهای H بعلل مختلف ممکن است مثبت شوند ولی بدون مثبت شدن آگلوتینینهای O ارزش ندارند.
مثال شش – آزمایش ویدال بیماری با آنتی ژنهای D و d به نسبت قابل ارزشی مثبت شده و با
آنتی ژنهای a و b هم به نسبت 1:100 و 1:200 بترتیب مثبت گردیده است (ستون 6 جدول):
این مورد را چنین می توان تفسیر کرد که بیمار بیش از سه ماه قبل واکسن T.A.B زده است ولی درحال حاضر نیز به بیماری حصبه مبتلا می باشد.
مثال هفت – جواب آزمایش ویدال بیماری با آنتی ژن d به نسبت 1:200 مثبت و با بقیه
آنتی ژنها منفی است (ستون 7 جدول). در این مورد چهار امکان زیر را می توان تفسیر کرد:
الف –بیمار چندین سال قبل، با واکسن T.A.B واکسینه شده، در حالیکه فقط آنتی کر
ضد d در سرم او باقی مانده که در اثر تب نامعلوم فعلی مقدار آن افزایش یافته است.
ب – بیمار سالها پیش مبتلا به تیفوئید شده و اکنون در اثر بیماری نامعلومی تیتر آنتی d او افزایش یافته است.
ج – در موارد بسیار نادر ممکن است شخص مبتلا به عفونت سالمونلائی شده باشد که
آنتی ژن H میکروب با d باسیل ابرت مشترک است ولی از نظر آنتی ژن O با یکدیگر اختلاف دارند. بهترین راه تشخیص قطعی بیماری، کشت مدفوع و تشخیص میکروب سالمونلا می باشد.
د – اگر بیمار مبتلا به تیفوئید، در اوائل بیماری و قبل از آنکه آنتی بادی علیه آنتی ژن O در سرم او ظاهر شود، داروی کلرآمفنیکل یا کورتیکوستروئید و یا هر دو را دریافت نماید، ازپیدایش آنتی بادی بر علیه آنتی ژن O جلوگیری خواهد شد. این داروها ظاهرا مانع سنتز آنتی بادی بر علیه آنتی ژن O
می شوند و جواب بدین صورت بدست می آید. در این موارد باید آزمایش ویدال را پس از چند روز تکرار کرد و اگر عیار d بالا رفت دلالت زیادی بر مبتلا بودن شخص به تیفوئید دارد. البته باید در نظر داشت که در احتمال مورد ج نیز تیتر آنتی بادی بر علیه آنتی ژن d در آزمایش مجدد ویدال بالا
می رود.
بحث در آزمایش ویدال:
امروزه آزمایش ویدال در کشورهای توسعه یافته به دلیل پائین بودن تیتر آگلوتی نین O در بیماران و درصد بالای منفی کاذب انجام نمی شود و بجای آن بیشتر از روشهای باکتریولوژیک کشت نمونه یا روش ایمونوآنزیمی الیزا (ELISA) استفاده می شود. در کشورهای در حال توسعه اگر چه مثبت کاذب به دلیل اندمیک بودن تیفوئید و بالابودن تیتر آگلوتی نین O زیاد دیده می شود ولی هنوز آزمایش ویدال یکی از بهترین راههای تشخیص بیماری تیفوئید خصوصا وقتی که آزمایشات باکتریولوژیک منفی ولی تب طولانی شدید در کار است، می باشد. ارزش آزمایش ویدال وقتی است که حداقل بفاصله یک الی دو هفته نمونه گیری سرم انجام بگیرد و هر دو نمونه در یک زمان آزمایش شوند. در اینصورت اگر افزایش تیتر (معمولا چهار برابر یا بیشتر نشان دهد، دلالت بر بیماری می باشد. لازم به تذکر است که گاهی ممکن است در اوائل بیماری به دلیل استفاده از آنتی بیوتیکها، سنتز آگلوتی نین ها متوقف یا افزایش تیتر نشان ندهد. بنابراین منفی شدن آزمایش ویدال، دلالت بر فقدان صددرصد بیماری نمی باشد.
گاهی ممکن است آگلوتینینهای مادری سبب مثبت شدن anti-H در سرم نوزادان کمتر از 6 ماه شود . این آنتی بادیها از کلاس IgG می باشند که از جفت عبور می کنند ولی anti – O به دلیل اینکه از کلاس IgM است، در صورت مثبت شدن تیتر قابل قبول، دلالت بر بیماری سالمونلا درنوزاد است و anti-H به تنهائی ارزش ندارند.
حاملین سالم (Carrier) میکروب سالمونلا تا سالها باکتری را در صفرا و روده کوچک نگهداری
می کنند و حاملین سالمونلا تیفی معمولا دارای آگلوتی نین Vi در خون هستند ولی در آزمایشگاه ویدال بعلت استفاده از آنتی ژن خالص Vi(Crude)، موارد مثبت کاذب بسیاری دیده می شود. امروزه آنتی ژن خالص Vi را از میکروب Citrobacterfreundii استخراج و برای ازمایش استفاده می نمایند. آنتی ژن Vi این میکروب کاملا مانند سالمونلاتیفی می باشد و موارد مثبت کاذب با این آنتی ژن در آزمایش ویدال معمولا مشاهده نمی شود. برای شناختن ناقلین سالم و بیمارانیکه تب طولانی و شدید دارند ولی آزمایش ویدال آنها منفی می باشد، باید کشت نمونه از مغزاستخوان، ناحیه فوقانی روده کوچک، خون منعقد شده یا تکرار کشت مدفوع روی محیطهای اختصاصی مانند Oxgall داده شود تا میکروب را جدا و شناسائی کرد.
در بعضی از بیماران مبتلا به بیماریهای خود ایمنی مانند آرتریت روماتوئیدی، آزمایش ویدال ممکن است مثبت شود. بعلاوه سالمونلاها با بعضی از باکتریها از جمله بروسلا، پاستورلاها، ویبریونها و بعضی از آنتروباکریاسه ها، ساختمان آنتی ژنی مشترک در قسمت آنتی ژن سوماتیک O دارند.
