آزمايش كراس مچ ماژور

آزمايش كراس مچ ماژور كه كراس مچ مستقيم يا Forward نيز ناميده مي شود قسمت اصلي آزمون سازگاري را تشكيل مي دهد و به دو منظور اصلي نيز انجام مي شود:

1ـ پيشگيري از واكنش هاي ايمونولوژيك نامطلوب

2ـ حداكثر بهره گيري بيمار از خون تجويز شــده

عوارض ترانسفوزيون نامتجانس ، با علائم باليني بارز و مشخص در حين يا متعاقب تجويز خون ناسازگار پديدار شده و علائم آشكار هموليز ( انهدام سريع گلبولهاي قرمز ) را بهمراه دارد و در موارد خفيف تر تخريب گلبولهاي قرمز بتدريج و يا بصورت ديررس صورت مي گيرد و با كاهش اعمال حياتي آنها همراه مي باشد ، در اين آزمايش سرم فرد گيرنده خون را با گلبولهاي قرمز فرد دهنده مجاور كرده و واكنشهاي آنرا بررسي مي كنند ، در اين روش آلوآنتي بادي هاي موجود در سرم بيمار ( نسبت به گلبولهاي قرمز دهنده ) مشخص  مي شوند .

روش :

1-  سه عدد لوله را به صورت  IDC , Alb , RTعلامت گذاري كنيد :

• (Room Temperature) RT براي تجسس آلوآنتي بادي هاي سرد

• Alb (Albumin) و IDC (Indirect Coombs) براي تجسس آلوآنتي بادي هاي گرم

2- داخل لوله RT ، يك قطره سرم بيمار بريزيد

 داخل لوله Alb ، 2 قطره سرم بيمار بريزيد

 داخل لوله IDC ، 3 قطره سرم بيمار بريزيد

 ( كليه لوله ها را از نظر ريختن سرم بيمار كنترل كنيد)

3- در هر يك از لوله ها يك قطره از سوسپانسيون 3 تا 5 درصد گلبول قرمز دهنده بريزيد .( كليه لوله ها را از نظر ريختن گلبولهاي قرمز كنترل كنيد )

4-  لوله RT را يك ساعت در حرارت اتاق قرار دهيد . لوله IDC را يك ساعت در بن ماري با دماي 37   درجه سانتي گراد قرار دهيد .

5- لوله Alb را به مدت يك ساعت در بن ماري 37 درجه سانتي گراد قرار دهيد ، پس از گذشت نيم ساعت از كنار لوله به آرامي يك قطره آلبومين گاوي 22درصد اضافه كنيد (بدون مخلوط كردن)

6- پس از اتمام يك ساعت لوله هاي RT و Alb را به آرامي تكان داده و از نظر هموليز يا آگلوتيناسيون بررسي كنيد .

7- پس از طي زمان مذكور لوله IDC را از بن ماري بيرون آورده و 3 بار با سرم فيزيولوژي شستشو داده ، پس از آخرين شستشو و خالي كردن سرم فيزيولوژي لوله IDC را روي يك دستمال برگردانيد تا تمام سرم خارج شود و گلبولهاي قرمز كاملاً خشك شوند .

8- در مرحله آخر يك قطره آنتي هيومن گلبولين داخل لوله IDC ريخته و كاملاً مخلوط كنيد ، سپس لوله IDC را بمدت 30 ثانيه در سروفيوژ سانتريفوژ كنيد .

9- لوله IDC را از سانتريفوژ خارج كنيد و به آرامي تكان دهيد لوله را در مقابل روشنايي از نظر آگلوتيناسيون بررسي كنيد . در همه موارد ، نتايج منفي بايد از نظر ميكروسكوپي چك شوند .

نكته : براي تأييد نتيجه منفي لوله IDC مي توان از گلبول قرمز حساس شده استفاده نمود به اين ترتيب كه يك قطره گلبول قرمز حساس شده را به لوله IDC اضافه كرده ، پس از 30 ثانيه سانتريفوژ آگلوتيناسيون را قرائت كنيد واكنش مثبت با گلبولهاي قرمز حساس شده نتيجه منفي لوله IDC را تأييد مي كند در غير اينصورت نتيجه منفي لوله IDC اعتبار نداشته و تكرار آزمايش الزامي است .

آزمايش كراس مچ ماژور                      تفسير

RT     Alb       IDC                             

  ـ        ـ            ـ                    اين خون براي بيمار سازگار مي باشد .

 +        ـ            ـ                    بيمار داراي آنتي بادي سرد مي باشد .

  ـ        +          +                    بيمار داراي آنتي بادي گرم مي باشد .

آنتي بادي هاي سرد در دماي 4 درجه سانتي گراد داراي بيشترين شدت آگلوتيناسيون (4+) مي باشند و در دماي اتاق يا حتي 30 درجه سانتي گراد گلبول هاي قرمز را با شدت كمتري آگلوتينه مي كنند .

آنتي بادي هاي گرم در در دماي 37 درجه سانتي گراد واكنش (4+) را نشان مي دهند .

همزمان با آزمايش كراس مچ ، آزمايشات Auto control و (Ab Screening) نيز انجام مي شود كه در ادامه شرح داده شده اند .

آزمايش Auto Control

در آزمون سازگاري به عنوان كنترل از گلبولهاي قرمز و سرم بيمار استفاده مي شود كه همزمان با آزمايش اصلي و نيز همراه با آزمونهاي غربالگري آنتي بادي اصلي و نيز همراه با آزمونهاي غربالگري آنتي بادي انجام مي شود ، استفاده از اتو كنترل نشان خواهد داد كه آيا آنتي بادي موجود در سرم بيمار بر عليه سلولهاي خود اوست و يا بر ضد سلولهاي تزريق شده مي باشد .

اتو آنتي بادي ها دو نوع هستند : سرد و گرم كه نوع گرم آن اهميت باليني بيشتري داشته و اكثراً برعليه آنتي ژنهاي سيستم Rh ايجاد مي شوند .

روش انجام آزمايش اتوكنترل نيز مشابه Cross Match است با اين تفاوت كه به جاي گلبولهاي قرمز دهنده از گلبول خود بيمار استفاده  مي شود . سرم بيمار را با گلبولهاي خودي در شرايط مختلف IDC , Alb , RT مجاور كرده و نتايج را قرائت مي كنيم .

درصورت مثبت بودن اتوكنترل بايد از خوني جهت تزريق استفاده كرد كه نسبت به اتوكنترل ضعيف تر بوده و يا معادل آن باشند .

با اينكه از انتقال خون به بيماران مبتلا به WAIHA (Warm Auto immune Hemolytic Anemia) تا حد امكان اجتناب مي شود ، اما مي توان از خوني كه داراي كمترين ناسازگاري ( نسبت به اتوكنترل ) باشد جهت انتقال به بيماران داراي  اتوآنتي بادي با ويژگي نامشخص ، استفاده نمود.

غربالگري يا آشكارسازي آنتي بادي (Ab Screening) يا (O Cell)

در اين آزمايش از معرف Ocell براي تجسس آنتي بادي نامنظم استفاده مي شود . معرف OCell از  گلبول قرمز O+ تهيه مي شود و داراي اكثر آنتي ژنهاي مهم و شناخته شده است .

سلولهاي معرف OCell را مي توان به صورت جداگانه ( حداقل گلبولهاي قرمز يك فرد ) با گروه خوني O+ تهيه كرد سلولهاي معرف اسكرين  را نبايد به صورت Pooled (مخلوط چند گلبولO+) تهيه نمود زيرا باعث رقيق شدن آنتي ژنها و واكنش mixed Field  مي شود .

روش آزمايش مشابه آزمايش كراس مچ مي باشد ولي به جاي گلبول قرمز فرد دهنده از سوسپانسيون Ocell استفاده مي شود .

روش :

1-سه عدد لوله را به صورت IDC , Alb , RT علامتگذاري كنيد .

2- داخل لوله هاي IDC , Alb , RT به ترتيب يك ، دو و سه قطره از سرم بيمار اضافه كنيد و لوله ها را از نظر ريختن سرم كنترل كنيد.

3- در هريك از لوله ها يك قطره از سوسپانسيون 3 تا 5 درصد گلبول O بريزيد.

4- مطابق با آنچه در آزمايش كراس مچ شرح داده شد لوله  RTرا يكساعت در حرارت اتاق ، لوله IDC را يك ساعت در بن ماري 37 درجه سانتي گراد و لوله Alb را يك ساعت در بن ماري 37 درجه سانتي گراد قرار دهيد بعداز گذشت نيم ساعت به لوله Alb يك قطره آلبومين گاوي 22 درصد اضافه كنيد و مجدداً نيم ساعت در بن ماري بگذاريد .

5- پس از طي زمان هاي ذكر شده لوله   RTو Alb را بدون سانتريفوژ از نظر وجود آگلوتيناسيون بررسي كنيد .

6- لوله IDC را سه مرتبه با سرم فيزيولوژي شستشو داده و بار آخر يك قطره آنتي هيومن اضافه كرده و 30 ثانيه در دور 3400 سانتريفوژ كنيد و از نظر آگلوتيناسيون بررسي كنيد .

اگر در مرحله RT واكنش مثبت مشاهده شود آلوآنتي بادي از نوع Cold Antibody بوده و اگر در مرحله Alb  يا IDC واكنش آگلوتيناسيون مشاهده شود مؤيد وجود Warm Antibody  مي باشد ، جهت تعيين هويت اين آنتي بادي انجام Panel test ضروري است .

 شناسايي آنتي بادي

استفاده از پانل گويچه هاي قرمز خون

شناسايي آنتي بادي از طريق بررسي يک پانل گسترده از گويچه هاي قرمز واکنشگر در مقابل سرم فرد گيرنده و با استفاده از تکنيک آنتي گلوبولين غيرمستقيم صورت مي گيرد. ايمونوهماتولوژيست الگوي واکنش سرمي مثبت و منفي را با فنوتيپ آنتي ژنها مقايسه نموده و نتيجه گيري مي کند. در شناسايي آنتي بادي بايد از کفايت سلولهايي که داراي ترکيب آنتي ژني متفاوت مي باشند و جهت شناسايي قطعي يک آنتي بادي واحد يا ترکيبي از آنتي باديها در سرم معيني آزمايش مي شوند، مطمئن شد.

يکي از اولين گامها، رد کردن آنتي باديهايي است که به خاطر آنها، سرم در واکنش با سلول شناخته شده از نظر حمل آنتي ژن مربوطه نارسا مي باشد. بهترين کار اين است که آنتي باديها را بر اساس سلولهايي که شکل هموزيگوس يک آنتي ژن را نشان ميدهند رد کنيم. در يک پانل عملي استفاده از اتوکنترل و بررسي واکنش در دماي اتاق،0C37 و فاز آنتي گلوبولين براي ارزيابي شدت واکنشها و تعيين نوع آنتي بادي ضرورت دارد. جزئيات بيشتر در مورد پانلها در کتب رفرانس موجود است.

تفسير كراس مچ ناسازگار :

اشكالات متعددي در جريان آزمايشات سازگاري پديد مي آيند كه لازم است به سرعت و دقت مورد بررسي قرار گرفته و راه حل مناسبي ارائه شود . در ذيل به شرح مهمترين موارد ناسازگاري مي پردازيم :

1ـ مثبت بودن آنتي بادي در آزمايش غربالگري ، منفي بودن اتوكنترل و مثبت بودن كراس مچ ماژور:

تفسير معمولي در اين حالت توليد آلوآنتي بادي يا مخلوطي از آلوآنتي بادي ها در گيرنده مي باشد كه توسط سلولهاي غربالگر مشخص شده است و در گلبولهاي قرمز اهداكننده آنتي ژن معادل آلوآنتي بادي ها وجود دارد . مطالعات تشخيص آنتي بادي ترجيحاً در سرم و يا پلاسماي بيمار و واحدهاي انتخابي صورت مي گيرد . اگر واحدهاي انتخابي نيز سازگاري نشان ندهند ، پاسخ مربوطه را در حالت هاي بعدي ملاحظه كنيد .

2ـ منفي بودن آنتي بادي در آزمايش غربالگري ، منفي بودن اتوكنترل و مثبت بودن كراس مچ :

كراس مچ ناسازگار در اين حالت ، مكرراً در سيستم ABO ملاحظه مي شود. گروه بندي ABO بيمار و اهداكننده بايد مورد مطالعه قرار گيرد . گروه بندي غلط ABO چه در مورد بيمار و چه در مورد اهداكننده باعث ناسازگاري ABO مي شود . همچنين ممكن است ، سرم بيمار حاوي آنتي بادي هاي سيستم ABO نظير آنتي A1 باشد كه در غربالگري با گلبولهاي قرمز (O) مشخص نشوند ولي در آزمايش با سلولهاي شناخته شده A1 تشخيص داده مي شوند .

حالت سوم حضور آنتي بادي هاي غيرفعال برعليه A و B است كه ناشي از انتقال خونهاي قبلي يا درمان با گاماگلبولين تزريقي مي باشد. مروري بر سابقه انتقال خون بيمار، اطلاعات لازم در تفسير نتايج را فراهم مي كند. چنانچه سرم بيمار فقط با يكي از واحدهاي اهدايي در مرحله كومبس غير مستقيم ( IDC ) مثبت شود، ممكن است واحدهاي اهداكننده از نظر آزمون كومبس مستقيم (DAT) مثبت باشند. بايد روي سلولهاي اهداكننده آزمايش (DAT) انجام شود. اگر آزمايش مثبت بود، نبايد در انتقال خون از آن استفاده شود. گلبولهاي قرمز اهداكننده اي كه قبلاً با ايمونوگلبولين حساس شده اند در آزمايش DAT مثبت مي شوند و در مرحله كومبس غير مستقيم ( IDC ) آزمايش كراس مچ نيز با همه گيرنده ها مثبت خواهند شد.

تفسير بعدي در مورد واحدهاي اهداكننده زماني است كه آزمايش كومبس مستقيم (DAT) منفي مي باشد، وجود آلوآنتي بادي در سرم بيمار برعليه يك آنتي ژن با شيوع كم كه بر روي گلبولهاي قرمز اهدايي وجود دارد ولي بر روي سلولهاي غربال كننده وجود ندارد مطرح مي گردد. در اين صورت آزمايش تعيين هويت آنتي بادي بايد با تعداد زيادي از آنتي ژن هاي با شيوع كم صورت گيرد.

3ـ مثبت شدن آزمايش غربال آنتي بادي، اتوكنترل مثبت و كراس مچ ماژور مثبت:

هنگامي كه هر سه آزمايش مثبت شود بايد سه احتمال را مورد مطالعه قرار داد . اولين مورد وجود اتو آنتي بادي است. به دليل اينكه بيشتر اتوآنتي بادي ها بر عليه آنتي ژن اختصاصي با شيوع بالا مي باشند، از اين رو با همه سلولهاي آزمايش شده واكنش مي دهند. اين موضوع، هم در مورد اتوآنتي بادي هاي سرد، نظير آنتي I  و هم در مورد اتو آنتي بادي گرم برعليه آنتي ژن هاي سيستم Rh صادق  مي باشد . در اين موارد براي برداشتن و حذف اتوآنتي بادي بايد روش هايي را به كار برد كه آلوآنتي بادي هاي احتمالي به واسطه واكنش هاي اتوآنتي بادي موجود در سرم بيمار پنهان نمانده باشد.

چنانچه بيمار به تازگي خون دريافت كرده باشد، تفسير دوم اينست كه يك آلوآنتي بادي با گلبولهاي قرمز اهداكننده واكنش داده، در نتيجه اتوكنترل مثبت مي شود، مثبت شدن آزمايش كومبس مستقيم اين نظريه را تأييد مي كند كه حساس شدن گلبولهاي قرمز اهداكننده به واسطه وجود آنتي بادي IgG مي باشد و با مطالعه تعيين هويت آنتي بادي و تعيين فنوتيپ نمونه خون تزريقي مشكل حل خواهد شد. تفسير سوم موارد غيرطبيعي در سرم بيمار و يا مشكلات مربوط به معرف ها درخصوص واكنش هاي سرولوژيكي مي باشد. تغيير نسبت طبيعي آلبومين و گاماگلبولين در سرم بيمار ممكن است باعث اتصال گلبولهاي قرمز به يكديگر شود كه در بررسي ميكروسكوپي به صورت رولو مشاهده مي شود.

در اين حالت، تمام آزمايش ها از جمله اتوكنترل در دماي اتاق و مرحله 37 درجه سانتي گراد ( در لولهAlb ) منظره آگلوتيناسيون را نشان مي دهند. از آنجا كه گلبولهاي قرمز را قبل از افزودن معرف آنتي گلبولين شستشو مي دهند، تشكيل رولو روي آزمايش كومبس غيرمستقيم  (IDC ) تأثيري نمي گذارد. اين پديده در بيماري هايي نظيرميلوم مولتيپل و نفريت ها ديده مي شود. درصورت اضافه كردن محلول نمكي سرم فيزيولوژي آگلوتيناسيون مربوط به رولو برطرف مي شود و به اين صورت مي توان رولو را از آگلوتيناسيون مربوط به آنتي بادي تفكيك كرد.  آزمايش كراس مچ ماژور